【关键词】归纳；总结；分析；结论
一、常现生物：
1.细菌：原核类：具细胞结构，但细胞内无核膜和核仁的分化，也无复杂的细胞器，包括：细菌（杆状、球状、螺旋状）、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体。
①细菌：三册书中所涉及的所有细菌的种类：
乳酸菌、硝化细菌（代谢类型）；
肺炎双球菌S型、R型（遗传的物质基础）；
结核杆菌和麻风杆菌（胞内寄生菌）；
根瘤菌、圆褐固氮菌（固氮菌）；
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌（为基因工程提供运载体，也可作为基因工程的受体细胞）；
苏云金芽孢杆菌（为抗虫棉提供抗虫基因）；
假单孢杆菌（分解石油的超级细菌）；
甲基营养细菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌（微生物的代谢）；
链球菌（一般厌氧型）；
产甲烷杆菌（严格厌氧型）等
②放线菌：是主要的抗生素产生菌。它们产生链霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、环丝氨酸、多氧霉素、环已酰胺、氯霉素和磷霉素等种类繁多的抗生素（85%）。繁殖方式为分生孢子繁殖。
③衣原体：砂眼衣原体。
2.病毒：病毒类：无细胞结构，主要由蛋白质和核酸组成，包括病毒和亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）①动物病毒：RNA类（脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、艾滋病病毒、口蹄疫病毒、脑膜炎病毒、SARS病毒）DNA类（痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、乙肝病毒）
②植物病毒：RNA类（烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒、大麦黄化病毒等）
③微生物病毒：噬菌体。
3.真核类：具有复杂的细胞器和成形的细胞核，包括：酵母菌、霉菌（丝状真菌）、蕈菌（大型真菌）等真菌及单细胞藻类、原生动物（大草履虫、小草履虫、变形虫、间日疟原虫等）等真核微生物。
①霉菌：可用于发酵上工业，广泛的用于生产酒精、柠檬酸、甘油、酶制剂（如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等）、固醇、维生素等。在农业上可用于饲料发酵、生产植物生长素（如赤酶霉素）、杀虫农药（如白僵菌剂）、除草剂等。危害如可使食物霉变、产生毒素（如黄曲霉毒素具致癌作用、镰孢菌毒素可能与克山病有关）。常见霉菌主要有毛霉、根霉、曲霉、青霉、赤霉菌、白僵菌、脉胞菌、木霉等。
4.微生物代谢类型：
①光能自养：光合细菌、蓝细菌（水作为氢供体）紫硫细菌、绿硫细菌（H2S作为氢供体，严格厌氧）2H2S+CO2[CH2O]+H2O+2S
②光能异养：以光为能源，以有机物（甲酸、乙酸、丁酸、甲醇、异丙醇、丙酮酸、和乳酸）为碳源与氢供体营光合生长。阳光细菌利用丙酮酸与乳酸用为唯一碳源光合生长。
③化能自养：硫细菌、铁细菌、氢细菌、硝化细菌、产甲烷菌（厌氧化能自养细菌）CO2+4H2CH4+2H2O
④化能异养：寄生、腐生细菌。
⑤好氧细菌：硝化细菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等
⑥厌氧细菌：乳酸菌、破伤风杆菌等
⑦中间类型：红螺菌（光能自养、化能异养、厌氧[兼性光能营养型]）、氢单胞菌（化能自养、化能异养[兼性自养]）、酵母菌（需氧、厌氧[兼性厌氧型]）
⑧固氮细菌：共生固氮微生物（根瘤菌等）、自生固氮微生物（圆褐固氮菌）
5.植物：C3和C4植物、阳生和阴生植物、豌豆、荠菜、玉米、水稻（2×12）、洋葱（2×8）、香蕉（3n）、普通小麦（六倍体）、八倍体小黑麦、无籽西瓜（3n）、无籽番茄、抗虫棉、豆科植物等。
6.动物：人（2×23）、果蝇（2×4）、马（2×32）、驴（2×31）、骡子（63）等。
二、重要的观点、结论：
1.生物体具有共同的物质基础和结构基础。细胞是一切动植物结构的基本单位。病毒没有细胞结构。细胞是生物体的结构和功能的基本单位。
2.新陈代谢是生物体进行一切生命活动的基础，是生物最基本的特征，是生物与非生物的最本质的区别。
3.生物遗传和变异的特征，使各物种既能基本上保持稳定，又能不断地进化。生物的遗传特性，使生物物种保持相对稳定。生物的变异特性，使生物物种能够产生新的性状，以致形成新的物种，向前进化发展。
4.生物体具应激性，因而能适应周围环境。生物体都能适应一定的环境，也能影响环境。
5.组成生物体的化学元素，在无机自然界都可以找到，没有一种化学元素是生物界所特有的，这个事实说明生物界和非生物界具统一性。生物界与非生物界还具有差异性。组成生物体的化学元素和化合物是生物体生命活动的物质基础。
6.糖类是细胞的主要能源物质，葡萄糖是细胞的重要能源物质。淀粉和糖元是植物、动物细胞内的储能物质。蛋白质是一切生命活动的体现者。脂肪是生物体的储能物质。核酸是一切生物的遗传物质。
7.组成生物体的任何一种化合物都不能够单独地完成某一种生命活动，只有这些化合物按照一定的方式有机地组织起来，才能表现出细胞和生物体的生命现象。细胞就是这些物质最基本的结构形式。
8.细胞膜具一定的流动性这一结构特点，具选择透过性这一功能特性。
9.细胞壁对植物细胞有支持和保护作用。线粒体是活细胞进行有氧呼吸的主要场所。叶绿体是绿色植物光合作用的场所。核糖体是细胞内将氨基酸合成为蛋白质的场所。染色质和染色体是细胞中同一种物质在不同时期的两种形态。细胞核是遗传物质储存和复制的场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心。
10.构成细胞的各部分结构并不是彼此孤立的，而是互相紧密联系、协调一致的，一个细胞是一个有机的统一整体，细胞只有保持完整性，才能够正常地完成各项生命活动。
11.原核细胞最主要的特点是没有由核膜包围的典型的细胞核。
12.细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
13.细胞有丝分裂的重要意义（特征），是将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去，因而在生物的亲代和子代间保持了遗传性状的稳定性，对生物的遗传具重要意义。
14.高度分化的植物细胞仍然具有发育成完整植株的能力，也就是保持着细胞全能性。
15.酶的催化作用具有高效性和专一性，需要适宜的温度和pH值等条件。
1口腔肿瘤术后下颌骨缺损及其并发症
1.1口腔肿瘤术后下颌骨缺损
口腔颌面部具有一个丰富的淋巴系统，口腔癌一般都有下颌骨骨膜的侵犯。Sudhir对22例口腔癌是否侵犯下颌骨进行探究，分别用X线、CT检查，发现有21例均有下颌骨的侵犯，并且和术后组织学相对照，其阳性率是一致的［2］。Tsuchimochi等用99mTcMDP骨扫描显示肿瘤引起了下颌骨松质骨的侵犯［3］。因此从肿瘤外科原则出发，必须作下颌骨切除，势必会引起下颌骨的缺损。
1.2下颌骨缺损的并发症
下颌骨缺损不仅仅影响面部美容，更重要的是可以引起如言语、吞咽、呼吸等功能的障碍。McConnel等对下颌骨切除后的病人进行口咽吞咽效率(OPSE)的检测，发现平均的OPSE值明显低于正常值，30个病例中有8例不能进食，其余只能进点流质［4］。Haribhakti也证实了下颌骨缺损可引起呼吸困难、睡眠质量差、下齿槽神经损伤的各种并发症，使患者的生活质量大大降低［5］。
2组织工程学骨再造的主要探究进展
组织工程学(tissueengineering)是生物医学工程中的一个新的分支，是应用生命科学工程学的原理和技术，设计、构造、改良、培育和保养活组织，以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科。其基本方法是将体外扩增的正常组织细胞，吸附到一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，然后植入机体缺损部位，细胞在生物材料逐渐降解吸收过程中形成新的组织，达到修复缺损，重建功能的目的。Vacanti［6］等运用组织工程技术在裸鼠身上再生软骨，国外已有较多的有关软骨组织的组织工程［7］；国内曹谊林教授首次采用组织工程技术在裸鼠体内再生了带血管的骨组织，并用于修复骨缺损，为骨组织缺损的修复提供了一条新的思路和途径。
骨组织的再生要求有三个基本的生物学因素参和，即细胞、生长和分化因子、细胞外基质材料，这也是当今组织工程探究中的三大课题。源细胞经过培养可以分化成成骨细胞；生长分化诱导因子可以促进成骨细胞的分化增殖，保持成骨细胞不衰老；生物可降解材料可作为细胞支架，支持细胞的附着、迁移和分化［8］。
2.1种子细胞(成骨细胞)
2.1.1来源的选择
理想的骨组织工程学种子细胞应具备下列特征摘要：(1)取材轻易，对机体损伤小；(2)在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖力；(3)植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性，有以下四种来源［9］。
2.1.1.1胚胎骨摘要：
目前较多使用的是胚胎或新生动物骨或人胚胎骨。由骨分离出的细胞主要含有4种成分摘要：骨内膜细胞、骨外膜细胞、骨细胞、未分化的间充质细胞。在体外培养中表现为两种形态摘要：可贴壁的成纤维细胞样细胞和不贴壁的圆球型细胞。利用骨作为来源获得的细胞在体外较易定向分化为成骨细胞，且具有生长迅速，传代繁殖快的优点。但此法会对患者造成手术损伤且供源有限。
2.1.1.2骨外膜摘要：
骨外膜分为内外两层。其中内层含有较多的骨原细胞和成骨细胞。已有较多的探究证实［10］来源于骨膜的细胞具有很强的传代繁殖和定向分化成骨细胞的能力，植入机体后能适应受区的环境，保持成骨活性，并最终通过软骨成骨而修复骨缺损，是目前广泛应用的成骨细胞来源。
2.1.1.3骨髓摘要：
骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质，骨髓基质细胞称作成纤维细胞集落形成单位，它具有多向分化潜能。骨髓具有取材方便、对供体损伤小、有流动性和可经皮注射等优点，具有广阔的发展前景。
2.1.1.4骨外组织摘要：
骨外组织如表皮细胞、成纤维细胞，这些起源于胚胎时期间充质的骨外部位的骨祖细胞称作诱导性祖细胞(IOPC)。此法取材轻易，对人体的创伤较小，体外培养传代繁殖力较强，提供了一条新的成骨细胞来源。
2.1.2成骨细胞和生物降解聚合物的体外培养
Attawia［11］等将成骨细胞种植在聚羟乙酸支架上，并在含10%胎牛血清的培养液中培养。7～10天后，成骨细胞粘附到聚合物支架上，并发生增殖，培养液中有钙化骨形成。Cooper［12］也进行了类似的探究，将成骨细胞分别种植到PMA、CPH、PMA/CPH共聚物上，2周的体外培养期间，成骨细胞发生了粘附、增殖，表达了较高的碱性磷酸酶活性，并有胶原合成。这些探究说明摘要：种植到支架上的成骨细胞在合适的营养环境中，能和聚合物很好地结合，并保持其增殖和成骨功能。
2.1.3成骨细胞形成骨组织的最佳细胞浓度
种子细胞的选择是组织工程修复缺损的关键步骤。适当的种子细胞浓度既可以直接修复缺损，又可以通过分泌细胞生长因子，促进间充质未分化细胞向种子细胞转化，加速愈合［13］。浓度过低，基质和细胞因子分泌不足，将限制细胞的生长。浓度过高，细胞之间将过早发生接触抑制，在取材上也有困难。夏万尧、曹谊林等的实验选择浓度从10×106/ml～70×106/ml的细胞进行探究，并作HE、Safranin染色观察，结果确定接种细胞浓度为50×106/ml时形成的软骨组织最佳［4］。至于骨组织形成的最佳细胞浓度尚有待进一步探究和探索。
2.1.4成骨细胞和环境的关系
2.1.4.1成骨细胞和细胞基质(ECM)的关系摘要：
成骨细胞的ECM包括无机和有机两部分，无机盐以羟基磷在石形式存在，主要功能为增强骨组织的力学强度；有机成分以Ⅰ型胶原为主，还包括骨钙素，骨桥蛋白，骨连接蛋白，纤维连接蛋白，层粘连蛋白等无定形基质。目前认为有机成分在成骨细胞增殖、分化过程中发挥重要功能。Nolan［15］等证实成骨细胞在脱钙骨基质上有很强的粘附和增殖能力。其中Ⅰ型胶原可刺激多潜能间充质细胞向成骨细胞方向转化，并促进成骨细胞表达碱性磷酸酶。
2.1.4.2成骨细胞和物理力的关系摘要：
把细胞基质结合物放入铸模里，使它们承受减切力、张力和其他一些在生长过程中受到的已知力，这也是设计和组织工程所需要的。施加物理力是形成和推动基因活动的重要因素，探究证实机械应力可促进成骨细胞表达β1Intergrin,从而增加成骨量［16］。
2.1.4.3成骨细胞和血管内皮细胞的关系摘要：在骨的改建过程中，成骨和血管化是密切相关的。血管内皮细胞可合成和分泌一系列可溶性的调节介质，包括生长因子和细胞因子，这些因子具有控制成骨细胞增殖、分化等功能；另一方面，Wang［17］等证实成骨细胞能分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)、FGF等促血管形成因子，功能于内皮细胞，促进血管形成。
2.2生物可降解材料
生物可降解材料又称为细胞外支架材料，理想的材料应具备下列条件摘要：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性，材料可最终被受植床组织完全替代；(3)易加工成型，并具一定的强度，抑制后能保持原状；(4)材料表面易于细胞粘附且不影响其增殖分化。
组织工程中应用的材料有天然材料和人工合成的高分子聚合物材料。天然材料如胶原、脱矿骨等；目前最受人青睐的材料是一些合成的生物降解聚合物如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和PLA/PGA共聚物。PLA和PGA具有良好的生物相容性和生物降解性，其代谢产物可通过代谢途径或经肾脏排出体外。学者们对这类材料探究取得了较大的进展，如Whang等［18］采用层压技术将聚合物制成三维立体多孔结构，其孔隙率达90%，孔的平均大小在16～32microm，组织形态学观察其成骨量要明显高于对照组，这样的微孔结构给种植细胞提供了较大的粘附面并有利于粘附的细胞和四周环境交换营养、气体和废物排泄。
最近有学者用脱乙酰的甲壳质(chitosan)和磷酸三钙(TCP)复合的海绵球作为成骨细胞培养的基质，发现该材料促进了成骨细胞的增殖和分化，有较高的碱性磷酸酶的表达及矿物化；光镜和电镜显示成骨细胞很好地附着在海绵球表面，并在14天时看到骨样物质的沉积［19］。
2.3生长调节因子
生长调节因子主要是生长因子和细胞因子。在组织工程中，某些种子细胞在体外传代培养后，经过一段时间后，细胞极易衰老，而生长因子能调节骨种子细胞的增殖和分化。对成骨细胞起着重要调节功能的生长因子有转化生长因子β(TGFβ)，胰岛素样生长因子(IGF)，骨形态发生蛋白(BMP)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)等。
成骨细胞本身可合成分泌TGFβ，细胞膜上有TGFβ的特异性受体，TGFβ功能于体外培养的成骨细胞，抑制其DNA的合成和AKP活性，促进胶原蛋白和非胶原蛋白的合成［20］。bFGF起着形态发生因子和促有丝分裂功能，刺激骨细胞的DNA合成，减弱OC、AKP的mRNA表达。PDGF可促进成骨细胞增殖，但对胶原合成无影响。BMP可诱导血管四周间充质细胞不可逆地向成骨细胞系方向转化，提高成骨细胞的AKP活性。IGF在骨组织中含量较高，约(1mg/kg)，可刺激成骨细胞增殖，促进胶原蛋白的合成。
Strayhorn［21］等采用鼠成骨前细胞株MC3T3E1和Northern杂交分析法探究了各类生长因子对成骨细胞增殖及相关基因的表达，显示单用PDGF抑制IGFmRNA的表达，阻断了骨钙素基因的表达，而单用IGF及BMP增加相关基因的表达。探究同时发现PDGF/IGF合用明显增强增殖分化相关基因的mRNA表达，促进了骨的形成。由此可见，生长因子之间的协同或拮抗功能还是很明显的，单一生长因子的功能或其浓度和剂量的改变是否会影响成骨细胞的增殖分化尚待进一步探究。
2.4临床前试验探究
临床前试验也即动物实验，其目的在于了解成骨细胞在体内的生长代谢、成骨情况以及生物材料的特性。
2.4.1成骨细胞—生物降解材料复合物移植于皮下的成骨功能
Levy［22］等在体外培养探究的基础上，将成骨细胞—PGA复合体移植到裸鼠背部皮下观察其成骨情况。植入后6周观察有软骨形成，在侵入的血管四周有新生的骨组织；20周时，可见大块骨组织形成。由此可见，成骨细胞—生物材料植入体内后先形成软骨，然后经历血管侵入和形态发生而形成骨组织。
2.4.2成骨细胞—生物降解材料复合物移植修复缺损
Lewandrowski［23］等用种植有成骨细胞聚合物修复骨缺损，以单纯聚合物植入作对照，发现实验组在术后1周即出现编织骨组织形成，至第4周时，新生骨组织渐趋成熟，至第8周时，缺损完全为骨组织充填，生物材料已完全降解吸收，未见免疫细胞浸润，Safrainin0染色阳性。
用带血管蒂的骨修复骨质缺损有很多优点，但这种移植材料取材极有限，能否利用组织工程技术来制造这种带蒂的骨修复材料又是当今的一大热点。已有学者［24］从胎牛肱骨骨膜分离的成骨细胞种植到聚合物支架上，体外培养2周后，将成骨细胞—聚合物复合体移植到无胸腺大鼠的右股血管四周，术后9周形成了新生的骨组织，最终形成了带血管蒂的小梁骨。
3组织工程学在颌骨缺损修复中的应用
下颌骨缺损的修复(尤其是肿瘤性的)一直是口腔颌面外科的难题，探究合适的骨缺损修复材料显得尤为必要。Henning［25］等在制作小猪下颌骨缺损模型的基础上，把聚乳酸和成骨细胞的复合物植入缺损区，再加上bFGF，采用三维模式观察骨组织的生长情况。结果发现新生骨组织均可在此支架上附着，并提出了较适宜的bFGF浓度为8μg/ml。组织工程骨再造在颌骨缺损修复的临床前试验有待进一步探究。
4组织工程骨再造的应用前景和存在新问题
以细胞和生物降解聚合物复合移植来恢复、保持和改善组织功能为特征的组织工程学技术为骨的修复提供了新的方法［26］，和其他骨修复方法相比具有以下优点摘要：(1)需要的供体组织少(细胞可在体外培养、增殖)；(2)可根据修复缺损的需要将植入物制成精确的三维外形。我们可以通过成骨细胞和生物降解材料的混合培养、骨的塑形及动物实验来进行特定形态骨再造的探究，以此可以修复大量的肿瘤性骨缺损的病例，其应用前景是光明的，但仍存在下列新问题摘要：(1)现有的合成性生物降解聚合物强度不足，受力时易变形，这样会损伤移植的细胞，材料性能有待进一步探究；(2)种子细胞的衰老新问题，尚需进一步探究生长因子对成骨细胞的功能；(3)对于非凡解剖形态的颌骨部位，如何将细胞—生物材料复合体固定到骨缺损区也是一个重要新问题。
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1ACS冠脉内局部炎症存在证据van-der-Wal等(2)研究死于AMI患者的斑块，其中含有泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞，巨噬细胞和T淋巴细胞是斑块破裂部位的主要细胞类型，并有白细胞和平滑肌细胞上人类白细胞抗原-DRⅡ(HLA-DRⅡ抗原)的大量表达。血清中巨噬细胞的标记物Neopterin在ACS中明显增加(3)。斑块肩部是炎症好发部位，有大量激活的肥大细胞存在，肥大细胞通过释放类胰蛋白酶(tryptase)和糜蛋白酶(chymase)引起基质降解从而使斑块不稳定、易于破裂。激活的肥大细胞常出现在梗死相关的冠脉血管的外层，其密度是正常的2倍，整个血管外层参与炎症过程。当肥大细胞激活时能释放组胺及其他内源性的血管收缩剂导致冠脉痉挛，从而引起临床症状。介入手术时取出斑块组织标本和尸检研究结果是一致的。ACS患者IL-2受体（CD25）阳性的T淋巴细胞百分比明显增加，缺血越严重增加越明显。表明不稳定斑块内免疫反应是激活的。T淋巴细胞释放的γ-干扰素通过抑制平滑肌细胞的增殖和减少胶原的合成使斑块不稳定(4)。所以活化的T淋巴细胞及其产物可作为一种新的预防和治疗ACS的靶标(5)。炎症细胞因子能引起粥样斑块部位血管平滑肌细胞的凋亡。粥样斑块内的巨噬细胞表达的基质金属蛋白酶(MMPs)使胶原降解，细胞外基质可使斑块结构不易于破裂。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1可上调MMPs。参与炎症反应并在粥样硬化形成过程起关键作用的许多基因可被转录因子核因子-κB（NF-κB）激活，NF-κB在转录活化单核细胞趋化蛋白-1方面是必需的，并能诱导金属蛋白酶基因。在人粥样斑块血管内膜和中膜发现有活化的NF-κB，且NF-κB活化的程度与冠心病程度相关，并发现UA患者白细胞中NF-κB选择性高度活化。
2ACS全身炎症存在的证据
研究认为，ACS冠状窦单核细胞和粒细胞上CD11b/CD18整联蛋白受体表达比主动脉窦多，活化的白细胞又增加CD11b/CD18整联蛋白受体与活化血小板和内皮细胞的相互作用的数量。在冠心病模型中发现，中性粒细胞与冠脉内皮相互作用可导致内皮功能紊乱。ACS患者循环中的中性粒细胞具有较低的髓过氧化物酶含量，UA治疗后，中性粒细胞髓过氧化物酶就会回升到与稳定型心绞痛(SA)和对照组相似，因此中性粒细胞活化是在UA的活动期。血白细胞数增加可以预测ACS预后(6)，炎症介质（如补体系统、集聚的免疫球蛋白、免疫复合物）、炎性因子和纤维蛋白降解产物均可导致中性粒细胞活化。在体外遇到免疫或非免疫刺激因素后，单核细胞表面就表达出组织因子并能特异性激活凝血过程。UA患者的血淋巴细胞能诱导培养的单核细胞组织因子活化，而SA和对照组则不能。淋巴细胞诱导单核细胞促凝血活性是活动UA的一个特征，这一特征在急性缺血后的8~12周可能不会被检出。在急性期，应用肝素能降低纤维蛋白肽A浓度。UA患者血中淋巴细胞活化并且免疫反应出现在不稳定的缺血症状之前。与SA相比，UA患者CD＋4和CD＋8淋巴细胞HLA-D表达增加。可溶性CD40配体在ACS中也明显增加(7)。反映患者体内炎症活动程度的CRP水平与冠心病尤其是ACS密切相关(8)。CRP可能促进血栓形成和动脉粥样硬化形成。IL-6水平在UA患者中明显升高，并与短期冠脉事件有关。在ACS患者中发现了可溶性细胞内黏附分子-1（sICAM-1）、IL-6和CRP增高的炎症反应(9)。补体系统激活也是与动脉粥样硬化相关的慢性炎症过程的一个主要组成部分。另有研究证实肺炎衣原体与ACS密切相关(10)。
3ACS的炎症指标
3．1CRP：CRP浓度在UA和AMI中是增加的(11)。心肌细胞损伤时，尽管肌酸激酶和肌钙蛋白T浓度正常，但CRP和血清淀粉样蛋白A是增加的。CRP和血清淀粉样蛋白A是一种非特异性的急性期反应蛋白，在大多数炎症、感染和组织损伤触发下，由细胞因子介导肝脏产生。介导肝脏急性期反应蛋白产生的主要细胞因子有IL-1和IL-6。大量流行病学研究证实，在健康人群中，CRP少量增加即可增加AMI的危险。因此有强有力的证据认为CRP是缺血性心脏病的独立危险因子，但机制还不清楚。CRP通过结合C1q和H因子激活经典的补体活化途径。在粥样斑块内，CRP和终末补体复合物一并存在。CRP也能通过单核细胞引起组织因子表达。CRP在全面判断心血管事件方面起到重要的作用(12)。ACS早期血运重建后，CRP增加是近期和长期预后的独立预测因子(13)。另外，SA患者放入支架后粥样斑块破裂，CRP浓度增高(14)。也有人认为UA患者住院时的CRP>3.0mg/L对其预后价值不大。
3．2细胞黏附分子：内皮是一种动力器官，通过各种机制抑制血液凝固和白细胞黏附，保持血液的流动性。组织损伤时，内皮细胞活化，表达细胞黏附分子，黏附分子介导活化的白细胞和血小板结合到内皮表面。白细胞结合和外渗的过程主要依赖于内皮细胞上的选择素和免疫球蛋白，选择素和免疫球蛋白通过与白细胞上的整联蛋白相互作用。人粥样斑块内内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞上均有ICAM-1表达。Pasceri等(15)报道CRP(>5mg/L)可引起脐静脉和冠脉内皮细胞内的ICAM-1、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和E选择素的表达。细胞外的这些黏附分子能被酶分解并在血清中检测到，被称为可溶性黏附分子。在ACS症状出现的最初72h,sICAM-1、可溶性P选择素和可溶性VCAM-1(sVCAM-1)持续增加，而可溶性E选择素下降。也有证据支持ACS患者sVCAM-1浓度增加与不良预后有关。sVCAM-1浓度增加与CRP一样可提供预后价值(16)。另外，VCAM-1被敲除小鼠可阻断粥样病变的发展(17)。这些证据肯定了炎症在ACS中的重要病理作用，并提示炎症反应的强度（以增加的CRP和sVCAM-1浓度表示）影响着临床预后(18)。
3．3其他炎性指标：血栓烷素B2局部释放到冠脉血管中与UA缺血性胸痛有关。UA患者尿中白三烯D4和E4分泌是增加的。这些发现与在患者中检测到全身炎症成分是一致的。血清淀粉样蛋白A也是一种肝脏产生的急性期反应蛋白，心肌细胞损伤时增加。IL-6在UA中是增加的，与CRP有很好的相关性，高浓度与不良预后相关。
4ACS后炎症持续存在的证据
尽管ACS患者经溶栓、抗凝、抗血小板和介入性治疗，但仍有12%~16%在出院后4~6个月发生了主要的心脏事件(19)。ACS临床症状消退后几周甚至几个月可持续不稳定，有可能再发UA、AMI或猝死。也有认为不论临床症状是否消退，炎症过程都持续存在。Biasucci等(20)报道血清CRP浓度在出院后也持续升高，3个月后随访，50%患者呈现Braunwald分级ⅢBUA。CRP持续升高与频繁住院有关。因此再发缺血事件与持续性炎症刺激有一种潜在的联系。Ault等(21)报道在急性冠脉缺血事件后，患者有血小板持续活化的证据。血小板相关的P选择素是血小板活化的敏感指标，在ACS临床稳定后1个月仍可保持升高，这种持续性的血小板活化可能是持续炎症刺激的结果。ACS后半年sICAM-1、sVCAM-1、可溶性E选择素和可溶性P选择素持续升高。但也有作者认为血小板活化指标和血清CRP浓度相关性较差。
5感染因素和ACS在动脉粥样硬化开始和发展中对感染因素的致病作用仍有争议。急性感染能改变参与缺血事件的血流动力学和凝血及纤溶系统。血管外慢性感染（如齿龈炎、前列腺炎和支气管炎等）能增加血管外炎性因子的产生，炎性因子可使远处粥样硬化加剧。血管内感染炎症刺激物可直接加重动脉粥样硬化形成。最常见的致病菌是肺炎衣原体和巨细胞病毒(CMV)。CMV可暗示冠脉介入后的再狭窄，43%血清反应阳性（而阴性只有8%）患者冠脉造影证实有再狭窄。再狭窄危险与IgG抗体也有关。ACS中IgE也是增高的(22)。有CMV感染的心脏移植患者嫁接部位易发生动脉粥样硬化。肺炎衣原体血清阳性与AMI和UA有关。Burian等(23)报道热休克蛋白60和肺炎衣原体抗体浓度增高是冠心病的独立危险因子，两者同时存在大大增加了危险性。所以热休克蛋白60在粥样硬化中也起到一定的作用(24)。从粥样硬化部位可分离出肺炎衣原体和CMV。尽管有大量的临床流行病学数据，但仍有问题没有解决，如在ACS中，感染因素是独立的致病原因还是合并因素，是否存在偶然的没有致病作用的共存因素等。
一、构建阶梯,循序渐进
我们知道:温故而知新。建构主义的观点认为:学习的过程是个体根据已有知识建构新知识的过程,是学习者以自己原有的经验系统为基础,对新的信息进行编码,建构自己的理解的过程,是新旧知识、经验之间反复、双向的相互作用。该观点对于内容之间联系非常密切,所有的知识都能够连成一个整体的生物学这门学科的教学工作,有着非常重要的指导意义。理解本节课这几个概念的关键是以本节的另一个重难点内容“染色体组”的概念为基础的,而减数分裂形成配子的过程是构建“染色体组”概念的必备知识,为了构建“染色体组”的概念,我首先领着学生温习了以下几个问题。
①人的体细胞有几条染色体?几对同源染色体?
②回忆减数分裂的过程和特点,回答以下问题:人体原始的生殖细胞通过减数分裂形成的和卵细胞中有几条染色体?几对同源染色体?试解释之。
③一个配子细胞中是否携带了本物种全部的遗传信息?有几个染色体组?人的体细胞中有几个染色体组?
在此基础上,学生不但对染色体组的概念的形成水到渠成,而且对染色体组的特点(a.一个染色体组中不存在同源染色体;b.一个染色体组中所含的染色体的形态、大小各不相同;c.一个染色体组中含有本物种全套的遗传信息,不能重复、不能缺少)理解更加深入,也为引入二倍体、多倍体的概念奠定了知识的阶梯。
二、对比理解,清晰明了
生物学概念是生物学知识结构和功能的基本单位,是学生抽象思维、解决问题和理论联系实际的基础,准确把握概念的内涵是教学最基本的要求。教师把一些易混、难以理解的概念联系起来,找出它们的共同点、不同点、联系点进行类比,不仅能使学生准确地掌握概念的本质,加深印象,不易遗忘,而且可以使教学效果事半功倍。学生能同时记住几个相关的概念,并且符合新课程标准的要求,能用比较思维的方式去学习。
(一)对一倍体、单倍体概念的对比探讨。
1.二者的发育起点。均是由配子发育而成。
2.二者细胞所含有的染色体组。一倍体只含有一个染色体组;单倍体既可能含有一个染色体组,又可能含有多个染色体组,如二倍体的单倍体含有一个染色体组,六倍体单倍体含三个染色体组,八倍体单倍体含四个染色体组。
3.二者的联系。二倍体的单倍体就是一倍体。
(二)列表对比单倍体、二倍体、多倍体的异同。
(三)实例对比,加深理解。
练习,实际是学生参加的在课堂上的一种实践,就好像是一种实战演习,对学生巩固知识来说,是常用而且必不可少的手段。例如,为加深印象,我设计了下面的通过具体数字来对比的练习。
完成下列表格:
通过以上对比、分析、训练,加深了理解,巩固了记忆,避免了概念之间的混淆。
三、转换角度,延深理解
教材内容对于这几个概念只是从染色体组的数目角度进行了介绍,为了加强各知识之间的联系和让学生从多角度加深对它们理解,提高学生分析问题、解决问题、重构新旧知识的结构的能力,我引导学生从以下几个方面认识它们的内涵。
(一)从染色体的形态、结构上去理解。
例如:(2007.海淀训练题)如图是各细胞中所含染色体的示意图:
1.图中能表示二倍体生物体细胞的是,可表示单倍体生物体细胞的是。
2.每个染色体组中含有2条染色体的细胞是。
3.C细胞含同源染色体的对数是。
4.图D表示的是一个含有4条染色体的有性生殖细胞,它是由?摇?摇?摇?摇体的性原细胞经后产生的。
通过解决这个问题,学生能够把抽象的同源染色体、染色体组的概念具体化、直观化,从而形象地理解单倍体、二倍体、多倍体,同时也训练识图、析图的能力。
(二)从基因型水平上理解
例如:已知某些植物体细胞的基因型分别为:
①AB②AaBbCc③AAA④AAaaBBBb
问:1.一定是单倍体的是?摇?摇?摇?摇,一倍体植物为。
2.若②③④均是由受精卵发育而成,则它们分别为几倍体?
该问题涉及基因与染色体的关系、基因型与同源染色体数量的关系,正确处理好以上关系,即可准确判断细胞内的染色体组数,从而解决相关问题。
四、追根求源,解除疑问
多倍体的成因本来是在“染色体变异在育种上的应用”中才出现的内容,为了帮助学生理解这几个概念,我将这部分内容提到前面学习。通过讨论,学生知道了染色体数目加倍的原因:温度突然降低或秋水仙素等化学物质的诱导,使纺锤体的形成受阻,导致染色体不分离,从而引起染色体数目加倍形成多倍体,对单倍体、二倍体、多倍体之间关系也更明了。
通过以上一系列的训练,我不仅把本节课重、难点内容解决了,而且使学生将新旧知识联为一体,同时还培养了学生的比较、推理、判断、识图等生物科学素养。
参考文献:
关键词清道夫受体A；基因表达调控
清道夫受体A（scavengerreceptorA，SR-A）是一类主要存在于巨噬细胞表面的膜糖蛋白，又称为巨噬细胞清道夫受体（macrophagescavengerreceptor，MSR）。大量研究表明，SR-A具有广泛的配体结合活性，能结合和内吞多种多聚大分子化合物如修饰脂蛋白、马来酰牛血清白蛋白（maleylatedbovineserumalbumin，M-BSA）、多聚次黄苷酸、丝氨酸磷脂及一些多糖和细菌脂多糖等，参与机体的防御、细胞粘附及信息转导等多种生理过程[1]。SR对修饰性脂蛋白如乙酰化LDL（AcetylatelDL，AcLDL）、氧化LDL（oxidativeLDL，oxLDL）的介导、内吞和降解，由于缺乏LDL受体样精确的下调功能，致使细胞能不断地摄取修饰脂蛋白，大量胆固醇在细胞内积聚形成泡沫细胞，在动脉粥样硬化斑块（AS）的发生发展中起着相当重要的作用，因此对SR-A基因表达调控及其功能的深入研究将有可能为AS研究提供新的思路。
1SR-A基因结构
SR-A包括Ⅰ型和Ⅱ型（SR-AⅠ和SR-AⅡ），是最早被分离纯化和克隆的清道夫受体，人SR-A基因定位于8号染色体上，长大约80kb，由11个外显子和10个内含子组成[2]。Ⅰ、Ⅱ型SR-AcDNA是由同一基因编码，按不同的剪切方式产生的。人SR-RⅠ和SR-AⅡcDNA分别含1353bp、1074bp开放阅读框，各自编码451和358个氨基酸的蛋白质。外显子1编码5’端非翻译区，外显子2编码细胞质区，外显子3编码转膜区，外显子4和5编码α-螺旋卷曲螺旋区，6～8外显子编码胶原区。第9外显子编码Ⅱ型、第10、11外显子编码Ⅰ型清道夫受体的C-末端。目前已克隆出的4种哺乳动物（小鼠、牛、兔、人）SR-A各区序列具有高度保守性，SR-AⅠ的氨基酸序列同源性达64%～81%，SR-AⅡ氨基酸序列同源性达60%～84%，这些保守序列与结构和功能的关系尚不清楚。α-螺旋区与功能性三聚体形成有关；序列分析及类比、突变等研究都强烈提示SR-A的正电荷胶原区是多聚阴离子配体的结合位点，缺少胶原区的SR-A则能防止配体的结合。将牛SR-A的胶原区内赖氨酸突变为丙氨酸，发现单独337位赖氨酸或327-334和340位赖氨酸的突变能减少AcLDL和oxLDL的结合和内吞[1]，说明SR-A的胶原蛋白域不仅是结合配体所需要的，而且也是其配体大多数为多聚阴离子化合物的主要原因。Ⅵ区又称为SRCR区（scavengerreceptorcysteinrich，SRCR），其作用仍不甚清楚，但许多含SRCR区的哺乳动物蛋白间接或直接与机体防御功能。
1.Ⅱ型的主要区别在于Ⅱ型缺乏富含半胱氨酸的Ⅵ区，而被6～17个C-末端氨基酸残基所取代。尽管C-端截短了，但Ⅱ型仍有高度的亲和性和广泛的配体结合活性，与Ⅰ型无明显差异。因此认为SRCR区（即Ⅵ区）对SR的结合活性和特异性并不是必须的。两型SR-A结构上的差异是否会有功能的不同，目前仍不清楚。
2SR-A基因的表达及分布
SR-A主要存在于不同组织和器官的巨噬细胞上，尤其是枯否氏细胞和脾淋巴结的巨噬细胞上[2]，在肝窦内皮细胞、成纤维细胞和某些平滑肌细胞亦有表达[4]，而在血管内皮细胞不表达[5，6]。免疫电镜结果显示，SR-A主要分布于巨噬细胞表面、囊泡和核小体上。两型SR-A可在不同组织器官的巨噬细胞上共表达，但表达量不同。
SR-A在单核巨噬细胞的表达调控有赖于巨噬细胞分化阶段，是巨噬细胞分化成熟的标志之一[7]。Geng等人[8]用RT-PCR和免疫印迹及荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cellsorter，FACS）研究了两型SR-A在不同类型细胞表达特点，发现在单核细胞两型SR-AmRNA、蛋白质均低，但在单核细胞向巨噬细胞的分化过程中，伴随Ⅰ型SR快速选择性升高，这种高水平表达维持到单核源性巨噬细胞变成充满胆固醇脂质的泡沫细胞为止，Ⅱ型SR-AmRNA无明显改变。提示Ⅰ型SR-A在单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞赂泡沫细胞的转化过程中均起着相当重要的作用。
血管内皮细胞有清道夫受体活性，但研究表明原代培养的兔静脉和牛主动脉内皮细胞上无SR-AⅠ、SR-AⅡ受体mRNA表达，用PMA诱导亦不能增加SR-A的表达和AcLDL的摄入，提示血管内皮细胞表面缺乏SR-A活性，其对修饰脂蛋白的摄入可能通过其它类型SR途径实现的[6]。某些SMC株可能存在不同水平的SR受体活性，用PMA处理的SMC对AcLDL的降解增加大约5倍，荧光分选法发现从喂高脂高胆固醇饲料的兔主动脉分离的SMC对AcLDL降解水平明显升高，提示AS斑块来源的SMC，其生物学特性就其SR活性而言是不同的，可能是某些生长因子能刺激SR表达，如果这些刺激因子是来源于巨噬细胞源性泡沫细胞，这就可以解释为何斑块中SMC源性泡沫细胞形成迟于巨噬细胞源性泡沫细胞[4]。Bickel等人[5]从新西兰兔主动脉SMC克隆出的SR与鼠、人、牛SR-AⅠ或Ⅱ比较，其cDNA及氨基酸水平的同源性均在70%以上。提示SMC上的SR-A受体活性可能是SMC源性泡沫细胞形成的主要原因。
3清道夫受体基因调控元件与表达调控
在细胞培养体系中，发现许多因素可影响SR的活性或基因表达，如佛波酯、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、血小板分泌产物等能促进SR-A表达、内毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素等可使SR-A表达下调。但不同的因子SR-A表达调控机制不同，这可能与作用于SR-A基因不同调节元件有关。
Moulton[9]等人将人和牛SR-A启动子序列-696～+46和-814～+46分别转到不同的细胞内，检测其对荧光素酶活性的影响，结果表明，在THP-1、P388D1和U937等巨噬细胞样细胞中，荧光素酶活性明显增加，而在HeLa细胞等非巨噬细胞样细胞中，荧光素酶活性较低。提示SR-A翻译起始区上游序列具有巨噬细胞特异性。通过基因转染、DNaseⅠ足迹分析、直接点突变等方法已明确了SR-A基因启动子有3个功能性顺式作用调节区，即启动子区、增强子区、抑制子区[10]。
SR-A启动子位于主要转录起始位点上游的-245～+46之间，包含两个转录因子结合区[9]。一是PU.1/Spi-1转录因子结合区。PU.1/Spi-1是一种ets区转录因子，PU.1中心识别基序（corerecognitionmotif）存在于大多数巨噬细胞及B细胞特异性表达的基因启动子上，如免疫球蛋白κ和λ基因及免疫球蛋白J链基因、CD11a、CD11c、巨噬细胞炎症蛋白-α等，PU.1/Spi-1能有效地介导SR-A的细胞特异性表达。提示SR-A启动子上PU.1/Spi-1识别位点与SR-A基因的巨噬细胞特异性表达有关。二是一个ets区蛋白复合物结合位点，可与AP-1基因家族蛋白（如c-Jun、JunB蛋白等）有高度亲和性，能形成三重复合物，这些蛋白质能共同促进SR-A的表达[7]。
序列分析表明SR-A基因启动子区缺乏通常的TATA盒，只是在SR-AcDNA的5’端翻译起始区上游-18～-37bp间有两个TATA样序列；没有LDL受体启动子的CCAAT盒；在SR-A的启动子区也没有发现类似LDL受体基因受固醇调节的固醇类反应元件序列，这一结果与清道夫受体活性一致，不受胆固醇调节，使脂质易于在细胞内集聚形成泡沫细胞[2]。
SR-A增强子区位于-4.1～-4.8kb［9，10］，是PMA诱导SR-A表达必需的区域。PMA对SR的转录激活作用是由AP-1和ets区转录因子分别结合到启动子和增强子区所介导的[7]。
SR-A抑制子区位于-4.8～-6.5kb处，可抑制70%～80%的SR-A启动子活性，能抑制未分化THP-1细胞向巨噬细胞的分化。抑制区的缺失，可使TPA诱导的SR-A表达水平明显增加，与疱疹病毒的胸苷酸激酶启动子共同组成的片段能抑制TPA诱导的加强反应。在-592～－570和-424～－402之间各有一个23bp的颠倒重复序列，这个重复序列中含有一段GGGATTA-CA序列，与介导白介素-2基因在T淋巴细胞特异表达的T细胞元件GGGPuTTT(C/A)A高度同源[2]。
这3个顺式作用元件中都含有AP-1基因家族成员蛋白的保守结合序列（TGA（G/C）TCA），同时，在增强子及抑制子区还含有ets区转录因子的结合序列。c-Jun、est2和组成型ras的共同表达，可协同增加含SR-A基因3个调节元件的片段的转录效率，提示SR-A的转录是ras、AP-1和ets区蛋白有关的信号转导通路密切相关的[11]。Horvai等人[10]的研究表达，291bp的SR-A启动子近端区域加上400bp的位于基因上游的增强子元件，在转基因小鼠中能驱动人生长激素受体基因在巨噬细胞的特异表达，在其它组织器官如脾、肠组织只有少量表达，甚至不表达，PU.1结合位点的突变则严重影响转基因的表达，这一转基因动物实验进一步证明SR-A启动子和增强子具有巨噬细胞特异性，PU.1结合位点是维持SR-A启动子活性及组织细胞特异性所必需的。因此，利用该基因的启动子和增强子可能建立巨噬细胞特异性转基因动物，这对研究某个特定基因对巨噬细胞功能的影响具有重要的应用价值。由于巨噬细胞SR-A基因是一类单核细胞向巨噬细胞分化过程中上调的有代表性的基因，能在巨噬细胞特异性表达。因此，转SR-A基因的细胞或动物也许能作为巨噬细胞分机机制研究有用的模型。
4清道夫受体的功能
4.1清道夫受体与动脉粥样硬化的关系
SR-A具有广泛的配体活性，与修饰脂蛋白AcLDL和oxLDL的高亲和性结合，可能是泡沫形成的主要原因。转染SR-A受体基因后的CHO细胞胞浆内脂质集聚，能形成泡沫样细胞；SR-A缺乏的小鼠腹腔巨噬细胞对AcLDL摄取减少80%，而对oxLDL的摄取只减少30%，提示SR-A是AcLDL的主要代谢途径，而oxLDL只有一小部分是SR-A摄入的，大部分可能其它受体途径[12，13]。SR-A和LDL受体同时缺陷的小鼠与只有LDL受体缺乏的小鼠相比，主动脉AS斑块面积减少40%[14]。这些结果提示SR-A在动物AS斑块形成中起着重要的作用。
免疫组化结果在显示不同阶段的人主动脉或冠脉粥样硬化斑块中均能检测到抗清道夫受体抗体的阳性细胞。在脂纹性病变中，染色反应为强阳性，而在斑块坏死区及纤维斑块中呈弱阳性，这些阳性细胞以巨噬细胞为主，其次为SMC[15]。提示，SR-A活性与人AS的病变程度密切相关，在早期SR-A受体分布较多，受体作用较强，而在斑块粥样坏死区、纤维斑块及钙化区（晚期病变）泡沫细胞减少或消失，SR-A受体作用减弱。
Wolle等[16]用鼠转铁蛋白启动子驱动牛SR-A型表达建立了转基因鼠，由于转铁蛋白启动子的肝组织特异性，使该转基因主要在肝内表达，仅微量出现在肾和脑内。实验结果表明SR-A基因在肝内的表达有助于消除血内的ApoB，使过剩的血浆胆固醇通过胆汁酸排出体外，具有抗AS的作用，可见SR-A在不同组织细胞的表达对AS的作用不同。
4.2清道夫受体与机体防御作用
巨噬细胞可以通过其表面的清道夫受体识别和吞噬体内受损害的蛋白质、细胞以及炎症或组织损伤部位的细胞碎片，参与机体的防御反应。正常胸腺巨噬细胞摄取类固醇处理的凋亡胸腺细胞可受到SR-AⅠ/Ⅱ单克隆抗体2F8的部分抑制。在体外培养中，SR-AⅠ/Ⅱ“敲除”的巨噬细胞对凋亡的胸腺细胞的吞噬作用下降了50%，这些结果提示，对清除死亡细胞SR-AⅠ/Ⅱ也是必要的[17]。
将致死量的单核细胞增多性李氏菌（L.monocytogens）或5×105PFU的单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV-1）注入到SR-AⅠ/Ⅱ基因“敲剔”的小鼠体内，该小鼠的存活率较野生型均明显减少，它们对内毒素性休克、单核细胞增多性李氏菌、HSV-1等感染更敏感[18]，感染内毒素后，体内肿瘤坏死因子（TNF-α）和IL-6产生增多，如果阻断TNF-α，可减少内毒素引起的死亡率。提示，激活的巨噬细胞SR-A通过清除内毒素、减少炎性因子的释放等起着重要的防御性保护作用。因此有人认为。提高SR-A的活性可能是一种控制内毒素性休克的新方法。
4.3清道夫受体能促进巨噬细胞的粘附[19]
硫代羟乙酸刺激而收集的正常小鼠腹腔巨噬细胞孵育过夜能牢固地粘附于培养板上，并可观察到很多伪足，但SR-AⅠ/Ⅱ敲除的小鼠腹腔巨噬细胞在孵育过夜后（2～20h）仍呈圆盘状，并很少粘附，培养40h后才能粘附；5mmol/LeDTA存在时，正常小鼠腹腔巨噬细胞能粘附于培养板上，而SR-AⅠ/Ⅱ敲剔的小鼠腹腔巨噬细胞不能粘附。说明在粘附的早期至少在开始培养的24h内。SR-A介导的粘附作用是很重要的，在以后的阶段，可能有其它粘附分子起作用。
参考文献
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AbstractItisquickconvientgood-repeatingandcheapthatexaminingthebioticmaterialscompatibilitythroughcell-culturingmethod,anditismoreandmoreimportantinevaluatingthecompatibilityofbioticmaterial.Thenewmaterialappeatingcontinouslycomplicatingofthepartandaimmaterialbeplantedintheintensityofmaterialstoxiceffectthereactionscomplicationofmaterialandbioticbody,allofthesedecidethevarietyofexperimentmethodandcellsincelltoxicityexperiment.Itisveryimportantthatchoicestherightexperimentmethodandcellsaccordingtothematerialscharacterthepartandaimthematerialbeplantedin.Theevaluationofbioticmaterialscompatibilitystressedonthechangingofcellsformandquantitybefore.Inrecentyears,moreandmorereportsappearaboutmaterialinflueancesthegrowth.adhesionproliferationandmetabolizingofcell.andpresentsthepointthattheevaluationstandardofbioticmaterialscompatibilityshouldbesetaccordingtotheactivecellsquantityandtheirbiningmanysubjectstechnologicaldevelopment,suchasimmunology,chemistry,radiationandshadowgraphy,thoroughlyinquiresthechangeingrelationofcellsstructureandfuntion,furtherlyclarifesthematerialseffectoncell,Itisthedevelopingdirectioninthefuturethatevaluatesthebioticmaterialscompatibilityincedd-culturingmethod.
KeywordsBioticmaterialCell-culturingCompatibilityToxicityexperiment
生物材料的临床应用已有较长的历史，广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能，还必须具有良好的生物相容性，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性，对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。
根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验），具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。
1细胞毒性试验方法的进展
1948年RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作，迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解，加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素，故迄今为止，国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。
细胞毒性试验由于细胞培养方式（如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等）的不同，细胞与材料之间有无间质（即细胞直接与材料或其浸出液接触，还是通过间质接触）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等）不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。
1.1间接法
最典型的间接法是琼脂覆盖法，该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态（膜、粉末或油脂状）等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小，易溶于水，其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并难溶于水，使用该法时材料毒性就难以表现出来。
为克服琼脂法的缺点，SabitaSriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜，将试样材料放在滤膜上，使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。vanLuyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生，因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。
1.2直接法
生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性，一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。
直接浸渍法：该法是形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。
另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时，由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度，同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是，对于与血液接触的循环系统来说，为了避免引起血栓形成，就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的，作出相应的生物相容性判断。
Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性，并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。
综上所述。细胞毒性试验方法多种多样，并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同，选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。
2实验细胞研究进展
目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞，该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（HeLa细胞）[10]。由于这两种具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。
由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织，HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现，人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。
从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。
对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物，因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液，在人体免疫系统中起着重要的作用，能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应，同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞，有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。
Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内，所接触的是骨环境，而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞，因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结，这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质，使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。
3细胞毒性的观察方法
以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量，通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤，首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变，出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降，细胞膜选择性通透屏障作用消失等，这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上，细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点，即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。
九十年代以来，越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。
在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）摄入法[16]、荧光染色法（如乙酰乙酸荧光素）[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。
放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。
四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。
荧光染色法：其基本原理是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。
流式细胞光度术（Flowcytometry,FCM）是近几年迅速发展起来的分析细胞的方法[22]。该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光，检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸，蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。
摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT―PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P＜0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。
关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性
中图分类号：R741
干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneuralstemeells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymalstemcdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。
1．材料和方法
1．1主垂试剂
高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。
1．2实验方法
1．2．1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3％的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102／cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15％胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5％的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80％融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。
收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。
1．2．2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2．5WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1．室温下孵育20min，流式细胞仪检测。
1．2．3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞，调整细胞密度备用。
1．2．4RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。
1．2．5RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCRbuffer1μl，RNasefreeH2O3.75μl，dNTPlμ，RNaseinhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-．go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCRbuffer10μl，纯净水27.75μl，
特异性上下游引物各0.5μl。内对照GAPDH上下游引物各0.5μl(30μmol/L)，cDNA产物10μl，按照以下条件进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸7min。取5μlPCR扩增产物加样至含溴化乙锭(EB)20g/l的琼脂糖凝胶中，在5V/cm下电泳60min，紫外透视仪下观察结果，并用凝胶扫描成像系统照相，PCR定量分析软件进行分析。
1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，随机分为3组，背部皮下组、颈部皮下组、对照组各6只。收集培养7d的MSCs，用PBS重悬并调整细胞密度为1x107/ml，非麻醉状态下，于裸鼠背部及颈部皮下分别无菌注射细胞悬液0.5ml，每只各4点．注入生理盐水作为对照组。定期观察，于3d、2周和8周取材，制作冰冻切片，HE染色，镜下观察。之后继续观察裸鼠生长情况至12周。
1．3统计学方法
数据以x＋s表示。采用SPSSl2.0软件对数据进行重复测量数据的分析，显著性水准取α=0.05。
2．结果
2．1脐血单个核细胞体外分离、培养后形态改变
培养前，脐血单个核细胞胞体较小，呈大小均一的圆形，直径约17μm，颜色较深，住高倍镜下可见其不停振动；培养后，细胞胞体增大，有破骨样细胞和梭形细胞两种形态。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。梭形细胞大小不等。形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。随着时间的推移，破骨样细胞减少而梭形细胞增多，即所需要的间质干细胞
2．2脐血干细胞的鉴定
流式细胞仪检测显示，扩增后的脐血MSCs既不表达造血干细胞的特异性表面标志CD34，也不表达内皮细胞的表面标志CD31，而CD29，CDl3，CD44等间质干细胞的表面标志均为阳性。这表明脐血MSCs是脐血中一群区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞。
2．3诱导后NSCs标志物的表达
Nestin和Musashi-1作为NSCs的标志物已经得到广泛应用。通过RT-PCR检测诱导后这两个基因的表达，使用PCR定量分析软件，分析各样本的PCR光密度。将各样本的PCR光密度值除以内参GAPDH的PCR平均光密度值，重复测量5次。结果发现NestinRNA在诱导前细胞中低表达，诱导后36h逐渐升高(p＜0.05)，72h后开始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后48h呈高表达(P＜0.05)。
2．4致瘤性
于注射后3d、2周和8周取材，肉眼观察裸鼠背部无明显增生物形成。组织学观察接种3d局部有细胞团块存在，团块中心细胞部分坏死。2周时，细胞团块不明显，大部分细胞被吸收。8周时，接种区组织结构与未接种区无明显区别。裸鼠存活12周以上，未见有肿瘤形成。与对照组比较，生长情况与皮肤状况无明显差别。
3．讨论
NSCs具有自我更新和多分化潜能，为神经系统疾病如帕金森病、阿尔海默病、卒中的功能重建带来了希望。无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，NSCs都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径。但NSCs来源有限，不适于展开大规模临床应用。如何获取大量的NSC供临床使用已成为当今干细胞研究的热点和难点。近年发现骨髓MSCs和造血干细胞(hematopoldiestemcells，HSCs)可分化成神经细胞。由于脐血MSCs和骨髓MSCs有极其一致的生物学特性，脐血中的干细胞可能更原始，增殖分化能力更强；而且脐血来源广泛、取材方便，所含有的干细胞数量更多。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应前景。
目前国内外学者已经使用多种方法从脐血中分离干细胞，最常用的方法是利用脐血干细胞体外贴壁生长的特性，将其从造血系统细胞中分离。此外，还可利用密度梯度离心、流式细胞仪分离法和免疫磁珠等方法。最近，有学者采用负极免疫筛选及限制性稀释的方法，分离得到脐血干细胞，使用流式细胞仪和免疫磁珠分离干细胞，操作方法复杂，花费高昂而且实验条件要求高。本实验结合使用密度梯度离心和体外贴壁生长的方法获得脐血MSCs，简单有效，成本低廉，对细胞损伤小，既适合各级实验室进行基础研究，也适合大规模将脐血细胞分离纯化，用于脐血干细胞建库㈣，应用于临床。
成功分离脐血干细胞后，使用NGF和RA联合诱导培养，用RT-PCR和免疫组织化学法检测神经干细胞表面标志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表达。NeSin最早由Lendahl等发现，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，巢蛋白的表达量逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止表达。此外，Sakakibara等亦鉴定出一种RNA结合蛋白Musashi，作为神经干细胞的标志物，Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSCs的鉴定。本研究发现新鲜分离的脐血干细胞弱表达Nestin.不表达Musashi-I；诱导后，脐血干细胞的Nestin和Musashi-1表达域逐渐增强，48h达到最强，进而逐渐减少。这表明脐血细胞具有向神经细胞分化的潜能。
[论文摘要]目的探讨大鼠视神经离断对神经干细胞一上丘组织共培养诱导分化的影响。方法采用机械分离，无血清选择培养的方法从孕14d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并进行传代培养。使用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定。采用显微手术的方法建立大鼠视神经离断模型，分别取正常大鼠、假手术和视神经离断大鼠的上丘组织进行体外培养。使用组织一细胞共培养系统将大鼠上丘组织与神经干细胞共培养，观察干细胞分化过程，对分化细胞进行鉴定，并与干细胞的自然分化过程进行比较。结果从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长，可形成单细胞克隆，具有多向分化能力，经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞。视神经离断大鼠的上丘组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养可以促进神经干细胞的分化，并诱导分化出thyl.1阳性的视网膜神经节细胞。结论从胚胎大鼠上丘可以分离培养出神经干细胞，与视神经离断大鼠的上丘组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化为视网膜神经节细胞。
1材料与方法
1.1主要材料和试剂
孕14d和3个月龄sd大鼠均由复旦大学医学院实验动物中心提供。高糖dmem／f12、neurobasa1、n2、b27购自美国gibeo公司；egf、b-fgf购自美国r&d公司；小鼠抗nestin单克隆抗体、小鼠抗thyl.1单克隆抗体购自美国chemieon公司；兔抗gfap购自武汉博士德公司；兔抗map-2单克隆抗体购自美国santacruz公司。
1.2动物分组与视神经离断模型
取3个月龄sd大鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组：正常对照组、假手术组和视神经离断组，每组动物均为10只。视神经离断组大鼠随机选择一侧眼，在手术显微镜下钝性分离显露视神经；在离后极约2mm处剪断视神经。术后于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验。假手术组动物外科操作同视神经离断组，但不离断视神经。正常对照组则不做任何处理。
1.3胚胎上丘nscs的分离与培养
取孕14d的sd大鼠，孕鼠孕龄的计算方法为：将雌雄大鼠合笼后，次晨检查发现阴栓者为孕0天。按照大鼠脑解剖图谱细心分离出上丘组织。胚胎上丘nscs的分离与原代培养程序参见冯东福等已建立的方法。
1.4单细胞克隆及鉴定
将第2代的神经干细胞球，吹打成单细胞悬液。使用连续稀释法，最终细胞密度为100／ml。参照reynolds和weiss的方法，建立单细胞克隆。
使用细胞免疫荧光法对传4代的细胞克隆进行鉴定，一抗为小鼠抗nestin单克隆抗体(1:100)，二抗为羊抗小鼠iggcy3(1:10)。使用tcs-sp2型激光共聚焦显微镜对荧光标记后的细胞克隆球进行观察，并进行计算机三维图像重建，激发波长为543mm。具体方法见冯东福等的报道。
1.5上丘组织培养
假手术组和视神经离断组大鼠在术后5d断头处死，取手术对侧的上丘组织，正常对照组随机取单侧上丘组织。上丘组织培养采用我们已经建立的方法。
1.6双室组织一细胞共培养系统
该系统由上下两室组成。上室为透明pet微孔(孔径0.4μm)滤膜培养小室(bectondickinson产品)，下室为配套的24孔培养板，可将上室悬吊起来。共培养时将上下室组合起来。
1.7神经干细胞的自然分化
取传4代的nscs悬液，从500r／min离心5min，弃上清，加入干细胞分化培养液(neurobasal培养液+b27(1：50)+10％fbs+谷氨酰胺4mmol／l)轻柔吹打。调整细胞密度为1×105／ml后将1ml悬液滴入下室，上室中不放组织块，仅加入分化培养液。把接种后的双室组织一细胞共培养系统放人c02培养箱中于37℃、5％co2条件下贴壁培养。隔日用相差显微镜观察细胞生长分化情况，贴壁培养14d后进行荧光免疫细胞化学染色。1.8上丘组织一神经干细胞共培养诱导分化
将传4代的nscs悬液以500r／min离心5min，弃上清，加入分化培养液轻柔吹打，调整细胞密度为1×105／ml后取1ml悬液滴入下室中于37℃5％c02条件下贴壁培养。3d后将已在体外培养4d的上丘组织移入共培养系统进行共培养。6d后将上室移去，神经干细胞继续培养至14d。
1.8分化细胞的鉴定
细胞免疫荧光染色步骤同前，根据需要上不同的一抗，抗体工作浓度分别为：map-2(1:50)、gfap(1:100)、thyl.1(1:100)。根据不同的一抗选择fitc或cy3荧光二抗。阴性对照使用pbs液代替一抗。对thyl.1阳性的培养孔，每孔随机选择3个克隆，在细胞疏松区域选择4个不同视野，记数总细胞数和thyl.1阳性细胞数，计算阳性率。
2结果
2.1上丘神经干细胞克隆形成及鉴定
大鼠胚胎上丘细胞接种48h后培养液明显黄变，大部分细胞死亡，存活的部分细胞胞体增大，折光性增强，伴有明显光晕。部分细胞出现分裂相，细胞可成对出现。随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，呈球形悬浮生长，边缘细胞折光性较强。对第2代细胞进行单细胞克隆培养后发现，细胞可形成亚克隆，这些来自单个细胞的亚克隆可以进行传代培养，并大量增殖。
使用激光共聚焦显微镜，进行三维重建后可以清晰地看到克隆球呈nestin阳性，中心的细胞较为
2.2分化细胞的鉴定
nscs的自然分化和各共培养组合诱导分化分化情况。各组神经干细胞大部分均分化为gfap阳性的神经胶质细胞。少量分化为map-2阳性的神经元。但只有上丘源nscs与视神经离断组的上丘组织共培养后可见有thyl.1阳性的视网膜神经节细胞分化。在该组分化的细胞中，thyl.1阳性细胞的比率为14.92％
2.3神经干细胞的自然分化
神经干细胞克隆在撤除丝裂原24h后贴壁。随着时问延长克隆球逐渐变扁平，并以克隆为中心产生放射状细胞迁移。克隆球边缘的细胞形状较不规则，多数细胞呈梭形或多角形，发出短而细的突起。7d后部分细胞可见长突起，细胞的折光性也各有不同。在相差显微镜下可见胞体较疏松，边缘部分有散在的迁移细胞，部分细胞可见有突起发出，亦呈nestin阳性。大、形态不规则、具有多个粗突起的胶质样细胞数量较多。而胞体有很强光晕，呈圆形或椭圆形、具有1～2个细长突起的神经元样细胞数量较少。随着神经干分化时间的延长，克隆球四周的细胞逐渐增多，迁移的距离也逐渐增加。在培养2周时出现大量细胞迁移，而克隆球边缘则逐渐模糊
2.4组织-神经干细胞共培养诱导分化
上丘神经干细胞经与组织共培养24h后均贴壁生长，克隆球逐渐变扁平。部分克隆球边缘有细胞突起发出，开始分化过程。在培养48h后可见细胞向外迁移，在相差显微镜下呈明显的“太阳征”在培养5d时，以克隆为中心产生的
3讨论
虽然干细胞的体外诱导分化已经有较多研究，但在体外诱导nscs向rgcs分化，特别是采用上丘组织与nscs共培养诱导分化的研究目前还未见报道。笔者采用了一种新型的双室共培养诱导nscs分化模式，细胞与组织不在一个平面上。下室为多聚赖氨酸包被的培养板，用于细胞培养。上室底部的pet膜使用细胞外基质包被，并经过蚀刻处理，有利于细胞的迁移，其组织贴壁率明显优于传统培养载体。组织接种到小室底部pet膜上后，与下室组合在一起进行共培养。由于pet膜上分布的孔径为0.4μm，所以膜上细胞分泌的分子会穿过pet膜孔到达下面，但细胞却无法进行直连续放射状细胞迁移，这些细胞的形态大多是圆形或梭形，多数细胞有较长突起，也有一些细胞体未见明显突起长。在培养2周后，大部分克隆明显减小，而不同克隆分化出的细胞交织成网，细胞间的突起相互连接。接接触，因此可以排除细胞接触因素的影响。
在哺乳动物中枢神经系统的发育过程中，各种神经元与对应的靶组织建立突触联系往往是其存活和进一步成熟分化的重要条件。大鼠出生时视觉系统尚未成熟，视网膜神经细胞，特别是节细胞，在出生后的成熟和分化，皆有赖于其靶组织一中脑上丘提供神经营养和诱向因子。因此笔者通过将nscs与rgcs的靶组织共培养的方法，探讨靶组织在体外环境下对nscs分化的影响。笔者发现视神经离断成年大鼠的上丘组织均可诱导nscs分化为rgcs，而假手术组和正常对照组的上丘组织则无此作用。
上丘对rgcs的作用是通过一系列复杂的化学因子调节的，其中较为重要的是神经营养因子的作用。frost等报道在上丘中脑源性神经营养因于的表达水平与rgcs发育程度相关，出生后15d内的仓鼠上丘bdnf保持在较高水平，而在成年期其含量下降约1／3左右。kretz等则发现另一种神经营养因子——睫状神经营养因子在发育期上丘的表达也具有同样的时间依赖性。这些神经营养因子在发育期的高表达，对于神经干细胞的增殖、分化同样具有重要作用。笔者从胚胎大鼠上丘组织中成功分离出具有多向分化能力的nscs，也说明发育期的上丘组织存在nscs存活、分化的微环境。
近年来临床研究报道异体造血干细胞移植后可发生供者细胞来源的白血病[9,10]。吴克复等[11]推测致癌因子应该源自受者细胞,即白血病患者体内的致癌因子也可能存在于除白血病细胞外的其他细胞,通过某种(些)途径传递给移植来的供者造血干细胞,导致这些移植来的细胞转化为新的白血病细胞。3.1隧道纳米管道(tunnelingnanotubes,TNT)可能是细胞间传递癌基因、癌蛋白的重要途径隧道纳米管道或简称纳米管道(TNT),是细胞膜形成的直径为50~200nm的细胞间管桥[12]。在体内淋巴细胞、单核细胞和树突细胞中均可观察到TNT,它的广泛存在提示其具有重要功能。TNT除了传送小分子物质外,还有核酸、受体、细胞器(如溶酶体、线粒体)等[13],细菌、病毒等微生物也能通过TNT传播[14]。研究[15]发现,一旦TNT建立就可以产生细胞内物质的传递,而在不同细胞间由TNT介导的瞬时融合事件同样可以传递肿瘤诱导因子。LevchnkoA等[16]报道P-糖蛋白(P-glycoprotein)可以在不同类型的细胞间转移,并导致受体细胞多药耐药性的增高。尽管这种细胞间迁移的潜在机制还不确定,但现有的数据表明其基本符合质膜成分经TNT的运输现象[17],而癌基因、癌蛋白是否能通过TNT在细胞间传输,尚有待进一步研究。3.2细胞融合与白血病复发的相关性细胞融合可能是癌基因、癌蛋白在细胞间传播的另一途径。胚胎发育过程中细胞融合是必不可少的细胞生物学机制,在组织修复和再生过程中起重要作用。但是在正常成体组织中细胞融合的发生率很低(约10-5),不恰当的细胞融合可能促进肿瘤发展。肿瘤细胞间、瘤细胞与正常细胞间融合产生杂交细胞,导致遗传重新编程,并可形成肿瘤干细胞[18]。这种肿瘤干细胞具有更强的增殖潜能以及转移、抗凋亡、多药耐药等多种恶性增殖特性,后者可表现为ABC(ATP-binding-cassette)转运蛋白表达水平的升高。吴克复等[11]报道了25份描述动物的杂交肿瘤;2例骨髓移植后患肾癌的病例证实肾癌细胞来自供者的造血干细胞,在肾脏中与转化的肾上皮细胞融合形成肿瘤细胞[19],表明细胞融合在肿瘤复发中起重要作用。
多次输血的免疫机制与急性白血病复发
在白血病治疗中采用的连续强烈化疗可以导致严重的骨髓抑制,因此输血成为白血病重要的支持治疗手段。通过大量对输血与恶性肿瘤预后的回顾性研究发现,输血病人较不输血病人肿瘤复发率高,且肿瘤复发率与输血量呈正相关。对儿童急性白血病的回顾性研究[20]也证实:急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病患儿中,复发组输血量较未复发组大,输血次数也比未复发组多,提示输血与急性白血病首次复发具有相关性。目前认为输血主要通过以下几种机制降低机体的免疫监视功能从而增加白血病复发的可能[21,22]:(1)克隆无能,主要组织相容复合物(MHC)在抗原递呈方面的异常使T淋巴细胞不能有效地发挥功能效应,从而产生免疫抑制———克隆无能;(2)单核-巨噬细胞免疫功能降低:白细胞介素-2(IL-2)和前列腺素E2(PGE2)均是较强的免疫调节剂,输血后单核巨噬细胞产生PGE2增加,而PGE2可降低巨噬细胞II类抗原表达和递呈功能,同时抑制IL-2的产生,降低了靶细胞对IL-2的反应;(3)T淋巴细胞及亚群的改变:T淋巴细胞不仅是细胞免疫的效应细胞,也是重要的免疫调节细胞,输血后辅助性T细胞/抑制性T细胞比值下降,并使NK细胞活性低下,从而削弱了其对T细胞、B细胞、骨髓干细胞增殖凋亡的调节作用;(4)非特异性免疫功能下降:血液是一种含多种物质的混合物,不仅血液中的白细胞在免疫抑制中起作用,血浆中的微聚物可使受血者纤维结合蛋白水平降低,纤维蛋白裂解产物可使受血者中性粒细胞脱颗粒,大量红细胞输注及铁盐负荷增加使受血者网状内皮系统负荷过重导致非特异免疫功能下降。
急性白血病复发的克隆演化机制
通过对8例AML患者复发前及复发后肿瘤细胞全基因组进行测序,并与同一患者健康体细胞的基因序列进行对照研究,揭示了白血病克隆演化的两种模式:(1)疾病发展演化中的主克隆/亚克隆优势选择。复发时白血病克隆已发生演化,但仍保留以前主克隆的某些免疫学和基因特征,化疗缓解后,白血病主克隆已明显受抑,但某个耐药寡/亚克隆在缓解中持续存在,并进一步增殖导致克隆演化和白血病复发。(2)白血病起病时存在的寡/亚克隆在疾病发展过程中被选择出耐药优势克隆。在疾病发展过程中由主克隆演化的耐药亚克隆增殖而导致克隆演化。研究[25]还显示,复发次数越多,发生克隆演化比例越高。但关于克隆演化与AL复发的关系尚需更大样本病例及更长随访时间的观察。
化疗与急性白血病复发的关系
AML复发患者中的突变不同于那些存在于原发瘤的突变,前者更容易出现DNA损伤的标记[24]。在肿瘤化疗中,普通的肿瘤细胞对治疗敏感,容易被消灭,但肿瘤干细胞具有很强的耐受力,会继续产生新的肿瘤细胞。ZengYX等[30]提出肿瘤细胞的一个重要特点就是基因组不稳定,可以演变成为各种基因型,那些与干细胞表型相似的肿瘤细胞能够耐受化疗,成为复发和转移的“种子”,并指出化疗一方面可能消灭肿瘤细胞,另一方面也可能加剧基因组不稳定性,诱导普通肿瘤细胞演变成干细胞样肿瘤细胞。WangJ等[31]将来源于单个普通肿瘤细胞的单细胞克隆用化疗药物处理,发现其能明显诱导生长能力特强、能抗拒化疗的干细胞样肿瘤细胞产生,并提出化疗后普通肿瘤细胞演变成肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源。但至今尚没有直接证据证实化疗可以决定肿瘤细胞的演化并促成疾病的复发。
【摘要】
目的探讨髓系细胞触发受体1(trem1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxldl)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况。方法先后用pma、oxldl诱导人u937细胞，使其转化为泡沫细胞。用rtpcr法及western印迹法检测pma诱导组、低密度脂蛋白（ldl）组和oxldl组细胞中trem1mrna及蛋白的表达。结果与pma诱导组、pma+ldl组细胞比较，pma+oxldl组细胞trem1mrna及蛋白表达水平均明显增高（p<0.05）。结论trem1可能参与泡沫细胞的形成，与动脉粥样硬化（as）斑块的发生发展密切相关，可能成为as治疗的一个新的靶点或监测as进展的一项新指标。
【关键词】泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化
泡沫细胞是动脉粥样硬化（as）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。u937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度脂蛋白胆固醇（oxldl）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells1，trem1）是一个30ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（tnfα）、白介素8（il8）和单核细胞趋化蛋白1（mcp1）的生成。Www.133229.COm因此，trem1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关trem1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用pma及oxldl诱导u937细胞向泡沫细胞转化，用rtpcr及western印迹法探讨trem1在此过程中的表达情况。
1材料与方法
1.1细胞来源及主要试剂
u937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48h，在含10%小牛血清rpmi1640培养基中呈悬浮样生长。
oxldl由yuanyuanbiotechnology提供。佛波酯购自sigma公司。rpmi1640培养基和trizol购自gibco公司。mmlv逆转录酶、taqdna聚合酶、10mmol/ldntp、oligo（dt）购自fermentas公司。小鼠抗人trem1单克隆体为abnova公司产品，兔抗人gapdh抗体为santacruz产品。ecl发光试剂盒为millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2u937细胞的分化及诱导
呈对数生长的u937细胞（细胞密度1.0×109/l），加入终浓为100nmol/lpma，孵育72h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样u937细胞。用无血清培养液培养12h后，换成含oxldl(终浓度为100mg/l)的培养液继续培养24h，将上述巨噬细胞样u937细胞诱导为泡沫细胞。
1.3油红o染色法鉴定u937泡沫细胞
将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红o染色20min，苏木素染色5min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。
1.4实验分组
将经pma诱导的u937细胞平均分为3组，分别为pma诱导组，pma+低密度脂蛋白（ldl）组和pma+oxldl组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的rpmi1640培养液、含ldl终浓度为100mg/l的培养液及含oxldl终浓度为100mg/l的培养液培养24h，收集培养细胞进行rtpcr检测及western印迹检测。
1.5rtpcr法检测培养细胞中trem1mrna的表达
按trizol说明书提取培养细胞总rna，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2μl用于pcr，反应条件为cdna预变性94℃5min后，经94℃30s，55℃30s；72℃30s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10min。反应结束后取pcr产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品pcr产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以gapdh密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。
根据genbank提供数据设计引物。trem1引物上游序列为5′tgctgtggatgctctttgtc3′，下游序列为5′cacagttctggggctggtat3′，扩增片段长度为491bp；gapdh引物上游序列为5′accacagtccatgccatcac3′，下游序列为5′tccaccaccctgttgctgta3′，扩增片段长度为452bp。以上引物均由上海捷瑞公司合成，用te缓冲液稀释成终浓度为15pmol/l，-20℃贮存备用。
1.6western印迹法检测培养细胞中trem1蛋白的表达
将培养细胞用细胞裂解液收集并充分裂解后，进行10%sdspage电泳，电转膜，丽春红染色，观察转膜效果；以pbst洗膜15min，共4次，室温下2%脱脂奶粉封闭1h；分别加适当稀释的一抗（trem1按1∶500稀释，gapdh按1∶2000稀释）4℃孵育过夜；pbst洗膜15min，共4次，加二抗（hrp标记的羊抗鼠igg）室温2h；pbts充分洗膜，用ecl试剂盒化学发光检测，gapdh为内对照，用图像分析仪分析各组条带光密度值。
2结果
2.1泡沫细胞的形态学鉴定
u937细胞经过pma诱导72h后，倒置显微镜下观察，多数细胞由圆形变成多角形，并易于聚集、贴壁，表明细胞已由单核细胞分化后具有巨噬细胞样特征。经oxldl油红染色后可见培养细胞明显显示出泡沫样改变，胞浆内较多的脂滴颗粒存在，且发现由于个别细胞吞噬了过多脂滴而致细胞体积增大（见图1），而未加oxldl的对照组细胞及ldl对照组细胞内无明显脂滴颗粒。
2.2trem1mrna及trem1蛋白在泡沫细胞中的表达
rtpcr结果显示，trem1扩增产物为492bp。结合western印迹结果显示，与pma组及pma+ldl组比较，pma+oxldl组trem1mrna及trem1蛋白表达量明显增加（p<0.05）；而pma组与pma+ldl组比较，差异不显著（p＞0.05），见图2，图3及表1。表1trem1mrna及蛋白表达结果（略）
3讨论
as是一个复杂的炎症免疫反应病理过程，as斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、oxldl负载的巨噬细胞（即泡沫细胞）和t淋巴细胞等炎性反应细胞浸润〔2〕。病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞，后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与oxldl结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。同时，巨噬细胞吞噬oxldl形成泡沫细胞时可生成血管内皮生长因子（vegf）、tnfα等细胞因子，这些因子在as的发生发展中起着关键作用〔3，4〕。近年来的研究发现，肺炎衣原体、幽门螺杆菌、巨细胞病毒等病原体通过激活炎症反应及损伤内皮而促进冠心病的发生发展〔5〕，提示as与感染性疾病的发病机制可能密切相关。
trem1属免疫球蛋白超家族成员，能显著放大由脂多糖（lps）等细菌产物引发的急性炎症反应，在感染性休克发生中具有重要作用，因而引起越来越多研究者的关注。研究表明，trem1不仅与细菌感染相关的急性炎症有关，在一些病毒感染性炎症、非特异性慢性炎症、缺血再灌注损伤、烧伤、甚至肿瘤的复发及预后判断方面都有重要作用〔6，7〕。
u937本质上是人单核细胞，经佛波酯、oxldl刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。u937的这一特性使其成为体外研究泡沫细胞形成机制的重要工具。本研究用rtpcr法及western印迹法对u937向泡沫细胞转化过程中trem1mrna及蛋白表达情况进行检测，结果发现单核细胞在向泡沫细胞转化过程中表达量不断增加，提示trem1参与泡沫细胞的形成，可能与as斑块的发生发展密切相关。因此trem1可能成为as治疗的一个新的靶点或监测as进展的一项新指标。
【参考文献】
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1新型干细胞
1.1诱导多能干细胞(iPS)
2006年日本京都大学Ya-manaka等［1］率先报道了iPS细胞的研究。他把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似［2］。2007年体细胞转变成“iPS细胞”的成果发表。Hanna等［3］用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了iPS细胞，然后用健康的基因取代了涉及镰刀形红细胞贫血症的基因，研究人员将它们输给供体小鼠，这些细胞在小鼠身上开始产生健康的血细胞，这些小鼠的疾病症状因此有了改善。将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞［4］。2009年，中国科学家利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性［5］。因干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。利用iPS技术可以用患者自己的体细胞制备专用的干细胞，因此不会有免疫排斥问题。然而，iPS的研究还只是起步阶段，有许多技术难题有待解决。例如现在的iPS技术主要采用病毒载体引入细胞因子，这些病毒随机基因组后存在着激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性，许多方法中还使用了c-Myc原癌基因，因此存在较大的致瘤风险。
1.2SP细胞
利用Hoechst染料进行造血干/祖细胞的流式细胞仪分析时，常会发现一群分布特殊的细胞，经过紫外激发后用双波长(450nm和675nm以上波长)监测，观察到这群细胞发出微弱的蓝色和红色荧光，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为侧群(SP)细胞。随着对SP细胞研究的不断深入，人们对SP细胞的分布、生物学特征、表型标记、信号转导机制及其与肿瘤发生的关系等方面的认识都取得了较大进展。近年来大量研究显示，除了造血系统和血液外，SP细胞在人和动物的许多重要组织器官，如肝、肺、脾、肾、脑、神经等均有广泛分布，其功能除了参与造血系统的重建外，还与相应组织更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性有关。SP细胞作为干/祖细胞的一种特殊类型，其发育和分化状态可能介于胚胎和成体干细胞之间，因此仍具有很强的多向分化潜能和增殖特性;同时，由于SP细胞广泛分布于各种组织器官中，含量丰富，又具有较明确的表型标记和分离纯化方法，所以较好地解决了其来源问题，这对推动干细胞理论研究与发展具有重要的意义，可在应用研究方面为组织工程和细胞治疗提供新的干细胞材料来源，也为组织再生修复与原位重建提供了新思路。
1.3Muse细胞
日本学者出泽真理和藤吉好泽率领的研究小组发现的新型干细胞被命名为“Muse细胞”［6］。由于这种干细胞是天然细胞，所以不容易癌变，安全性高于培养时需要植入基因的iPS细胞。存在于成人皮肤和骨髓组织中，含有“SSEA-3”蛋白质的细胞，它们能够发育成神经、平滑肌、骨骼肌、肝脏等各种组织。将这种细胞移植到实验鼠受损的皮肤和肝脏以后，这种细胞就与患部结合，成长为受损组织特有的细胞。具有多潜能细胞的特性，但其增殖性不高。这些细胞保留体内的分化能力，与胚胎干细胞不同的是，对免疫缺陷小鼠不构成畸胎瘤。因为这些细胞很容易获得，能进入细胞的分化与所有三个胚层的特性，而不需要导入外源基因。因此，对这些细胞为基础的治疗和生物医学研究具有巨大潜力。
2新型干细胞在心血管疾病方面的应用
2001年有学者首次报道将骨髓干细胞移植到梗死小鼠的心脏中，局部骨髓干细胞能够分化产生新的心肌细胞，提高心脏功能。随后有学者报道将骨髓单个核细胞移植到梗死缺血的心脏上，可以提高心肌梗死(MI)患者的心脏功能。此后，心肌再生疗法治疗成为当今全球的主要热点。
2.1治疗冠心病
干细胞疗法为MI的治疗带来了希望。在过去10年进行临床前和临床试验表明，几种类型的干/祖细胞可以减少梗死面积，改善心脏收缩功能。其机制包括:(1)新血管的形成，(2)介质的释放有利于血管生成和抗炎因子的释放，(3)心肌细胞功能恢复。心脏祖细胞和多能干细胞具有不容置疑的分化成心肌细胞和其他相应细胞的能力。因此，以促进细胞的存活及体内植入的干细胞疗法是极其重要的发展战略。目前已完成两种细胞类型的Ⅲ期临床试验:即骨骼肌成肌细胞和骨髓单核细胞(BM-MNCs)。在前者，由于骨骼肌成肌细胞增加了心律失常的风险，使得它的益处受到影响。多数研究表明，BM-MNCs治疗组对照组比较疗效显著。iPS细胞被广泛地应用于各种疾病的研究。由于它具有胚胎干细胞的特性，所以可以被诱导分化为心肌细胞，血管内皮细胞甚至是窦房结细胞。Gai等［7］报道，将人皮肤中成纤维细胞进行基因编程后制作出iPS细胞，在活体上形成与胚胎干细胞一样的能够跳动的心肌细胞。iPS细胞可以从患者自身提取，可将基因重新编程，因此对于基因遗传性心脏病，如心肌病、长QT综合征、Brugarda综合征等疾病重新编程，从而治疗该类疾病。它的应用不受伦理限制，无免疫排斥反应，具有其他移植细胞不具备的优点。但由于是病毒载体转染基因，有可能将病毒转染到宿主细胞，引起宿主病毒感染，甚至有畸胎瘤的风险。目前iPS细胞还用于基础研究中，尚未在临床应用。心脏SP细胞(CSP)可分为SCA1(+)/CD31(－)和SCA1(+)/CD31(+)SP细胞。利用荧光激活细胞分选，逆转录聚合酶链反应，检测细胞的增殖、分化和迁移等方法，在小鼠MI模型上SCA1(+)/CD31(+)CSP细胞表达干细胞和血管内皮细胞的特定基因，并驻留在血管中。这些细胞在体外和体内均能够增殖、分化、迁移和血管化。SDF-1α体外诱导这些细胞的迁移。更重要的是，MI后，SCA1(+)/CD31(+)SP细胞可以从非缺血区迁移到缺血区心肌，并形成筒状血管的结构［8］。研究结果表明，SCA1(+)/CD31(+)的心脏SP细胞能够从非缺血性心脏部位迁移到受损的心肌急性缺血性损伤的心肌细胞。SDF-1α/CXCR4系统可能会在这些细胞的迁移中发挥的重要作用［9］。
2.2治疗心力衰竭
目前心力衰竭的治疗方法有限，细胞疗法是一种很有前途的战略。心肌干/祖细胞具有的各种潜力，修复受损的心脏组织，包括更换(组织移植)、恢复(激活原位心肌祖细胞，旁分泌作用)和再生(干细胞植入形成新的细胞)。治疗心力衰竭的目的是补充收缩失败的心肌单元，但能够被成功诱导出cardiomyogenesis的数量有限，因此改善心功能程度较小，此时旁分泌机制可能更重要。目前对于治疗最有效的细胞类型仍不清楚，iPS细胞具有很大的潜力。宿主心肌细胞融合和结合的途径仍然有争议。作用机制、细胞类型或交付方式，时间效力和细胞治疗，药物治疗或辅助治疗剂量，以及最佳的细胞类型等还需要更多的研究。有研究表明，啮齿类动物和人类骨髓来源的SP细胞均能够在心肌上存活，人类骨髓衍生的SP细胞在增强左室收缩功能方面优于普通骨髓单个核细胞［10］。有关SP细胞的研究目前还在基础研究中，其是具有研究和开发潜力的一类新型干细胞。
2.3治疗心律失常
起搏生物基因疗法治疗病态窦房结综合征，心脏传导阻滞等缓慢性心律失常已经取得了长足进步［11－12］。此外，人类iPS细胞已被核实为药物筛选有用的工具。很多个体对心脏活性药物的反应有差异，利用ES细胞源性心肌细胞或iPS细胞来源的心肌细胞，筛选出个性化定制的抗心律失常药物，可以个体化治疗心律失常患者。
2.4心脏瓣膜的组织工程
组织工程心脏瓣膜的三大要素有种子细胞，细胞支架材料和细胞支架的复合，重构。应用生物可降解聚合物支架构建组织工程心脏瓣膜，已在动物实验中取得初步结果，为心脏瓣膜研制开辟了新途径。用于组织工程心脏瓣膜的种子细胞有内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及ES细胞。组织工程心脏瓣膜研究已经取得了很大进展，但是还有很多问题尚待解决和克服。如如何进一步提高种子细胞与支架的黏附力，干细胞定向分化中是否会引起基因突变和肿瘤等问题。然而，随着干细胞技术和组织工程技术的日益发展，这些难题终将得到解决。
2.5治疗肺动脉高压
1内皮细胞具体来源的内在理论机制假说
1.1婴幼儿血管瘤胎盘来源假说：由North等[3]在2000年首次提出，他们研究发现婴幼儿血管瘤均表达胎盘微血管标志物――层粘连蛋白、FcγRⅡ、葡萄糖转运蛋白-1（glucosetransporter-1,GLUT-1）和LeY，鉴于血管瘤独特的临床特点及与胎盘抗原的相似性，他们提出了血管瘤起源的两种假设：血管瘤是入侵的血管形成细胞在皮肤及皮下组织的间质中向胎盘微血管表型不规则分化的结果；血管瘤来源于栓塞的胎盘细胞。Barnes等[4]运用基因芯片技术对比了胎盘和婴幼儿血管瘤基因转录情况，发现其相似性远远超出了其他8种组织和其相关来源的病变组织的基因转录水平的相似性，进一步支持了该假说。
1.2内皮祖细胞来源假说：由Kleinman等[5]在2003年第一次提出，该研究小组通过分析血管瘤患者外周血中单核细胞中内皮祖细胞数，发现其比例为健康志愿组的15倍。此外，他们将获取的健康志愿者的内皮细胞在体外培养，发现也可以表达血管瘤特异的表面标志物：CD32与分层蛋白。上述研究提示血管瘤细胞与内皮祖细胞在分子生物学上具有相关性。
1.3血管瘤干细胞来源假说:由Khan等[6]提出，认为在血管瘤增殖期出现大量的血管内皮细胞的扩增，其来源可能为原本就已存在的血管瘤干细胞的克隆性增生。该研究小组从血管瘤组织中分离出具有干细胞表面特异标志CD133的细胞，并证明此单克隆细胞具有多项分化的潜能。
1.4成血管细胞来源假说：认为由胚胎发育过程中残留的成血管细胞发育形成单独的血管瘤组织[7]。增生期血管瘤内皮细胞共表达作为内皮细胞特异标志的CD34，作为淋巴内皮细胞的表面特异标志LYVE-1，作为单核细胞表面标志的CD14与作为树突状细胞表面标志的CD83。血管瘤组织内细胞表达的不同抗原，可以间接说明血管瘤组织是来源于具有多项分化潜能的祖细胞。
2外周环境因素在血管瘤发生发展过程中的影响作用
2.1雌激素水平异常：20世纪80年代中期,Sasaki等[8]发现增生期血管瘤患儿血清雌激素水平升高，且瘤体内有丰富的雌激素受体。Tang等[9]通过动物试验发现雌激素在血管瘤生长中扮演角色,雌激素促进内皮细胞增殖，形成毛细血管样结构。Sun等[10]的离体试验显示，雌激素协同血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）促进血管内皮细胞的增殖。而且对血管瘤组织雌激素受体的检测结果指出血管瘤可能为雌激素的靶组织。实验和临床的许多线索说明雌激素为血管瘤形成发展的重要影响因素，其主要通过调节包括基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-9，内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）及NO在内的关键的成血管因子来发挥作用。
2.2局部低氧分压与缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)：Ritter等[11]发现在婴幼儿血管瘤中单核细胞与粒细胞的存在，指出血管瘤的发生发展可能与局部的低氧环境有关。Kleinman等[5]在增殖期血管瘤中检测出HIF-1α的表达。最近的研究倾向于认为血管瘤组织中HIF-1α表达上调是因为血管瘤内皮细胞大量增殖却未形成完整的血管管腔，以致有氧血供不足，引起组织缺氧，进而导致其表达上调，引发一系列的组织损害，如溃疡。缺氧的微环境导致一些反应性的细胞因子的表达上调，除了HIF-1α，还有如间质细胞源性因子1α(stromalcellderivedfactor-1alpha,SDF-1alpha）和VEGF，后两者均促进内皮祖细胞的募集和增殖[12]。
2.3血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）：在以往关于肿瘤发病机制的研究中，学者们发现VEGF通过调节基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-2和-9的转录水平，诱导组织因子、蛋白水解酶及基质胶原酶的表达，改变细胞外基质和基膜，诱导肿瘤血管的生成[13]。VEGF似乎在新生血管形成的早期起促发作用,通过招募外周细胞和平滑肌细胞促进毛细血管节段形成和完整血管壁形成。血管内皮细胞周围的细胞对血管的整合和成熟非常重要，它们有三大职能：联系、调节内皮细胞活性，调节巨噬细胞活性[14]。我们现在知道血管生成素Angiopoietin-1与血管生成素受体Tie-2的相互作用维持了内皮细胞间的联接，稳定了血管壁。在血管形成的进一步过程中，这种平衡要暂时地被打破，内皮细胞分泌的MMP降解基膜、消化细胞外基质为新生血管的形成创造空间，分泌的angiopoietin-2解除外周细胞间的粘着。MMP引起的基质过度降解能导致血管结构的不稳定。比如：人脑动静脉畸形的患者，MMP的表达异常。
2.4能分泌细胞因子的间质细胞:血管瘤周围的支持细胞在血管瘤形成过程中所起的作用也被认为是不可忽视的起病因素。Nguye等[15]通过免疫化学发现血管瘤的内皮细胞与树突状细胞十分相似，后者分泌的细胞因子可能与血管瘤的发生有关系。Mulliken等[16]发现有肥大细胞对称分布于血管瘤新生血管管周。在增殖期血管瘤中，肥大细胞可以表达成纤维生长因子2（FGF2），后者被认为可以有效促进血管形成。另外，肥大细胞可以迅速促进并稳定维持VEGF的释放。这些研究提示肥大细胞可能在血管瘤的形成以及消退过程中起到复杂作用。
2.5影响细胞凋亡的基因表达异常：1998年,Razon等[17]用原位末端标记法检测发现在增生期血管瘤组织中细胞凋亡水平低，而在消退期血管瘤组织中凋亡水平升高5倍；免疫荧光双标记试验证明至少1/3凋亡细胞是内皮细胞。哺乳动物细胞主要有死亡受体通路和线粒体通路两种凋亡途径。前者主要涉及Fas/FasL及caspase-8,后者则主要与细胞色素C、bcl-2、bax和caspase-9等这两条通路在caspase-3汇聚。上述因子或基因的表达异常可影响血管瘤内皮细胞的凋亡,被认为是最关键性因子之一。现已知VEGF作为一种特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，与内皮细胞上的VEGF受体结合后，能引起血管内皮细胞分裂、增殖和迁移，促进新生血管形成[18],缺氧会影响VEGF的表达。缺氧可诱导HIF-1和HIF-2的表达，上调VEGF的转录因子，因此，在低氧环境下，VEGF被分泌，并与位于内皮细胞表面的受体相结合。这是组织对缺氧的一种代偿机制，通过诱导血管生长而增加氧供。相反，正常氧分压会下调VEGF的产生。血管瘤治疗临床研究反复显示：VEGF诱导的血管新生不是普遍的，只是严格局限于缺血部位[14]。
近年来，胰岛素家族与VEGF促血管新生作用之间的关系逐渐受到人们的重视。胰岛素样生长因子是一类重要的生长因子家族，包括胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、相应的受体和结合蛋白。Igf2基因位于人染色体11p15，IGF2蛋白是由67个氨基酸组成的单链弱酸性多肽，分子量为7144KD。Kawamoto等[19]研究发现，IGF2在人胎儿时期的含量远比成年期高，且出生后IGF2的表达主要在肝脏、神经组织等。它为多种细胞的有丝分裂原，在体内外都有很强的促进细胞增殖分化的能力[20]。近年来有研究表明，IGF2的过度表达与恶性肿瘤（如卵巢癌、结肠癌等）及其他增生性疾病联系密切[21]。
IGF2能与两种不同的受体即胰岛素样生长因子受体Ⅰ（insuline-likegrowthfactorreceptorⅠ,IGF-ⅠR）和胰岛素样生长因子受体Ⅱ（insuline-likegrowthfactorreceptorⅡ,IGF-ⅡR）结合,通过自分泌和旁分泌方式发挥其生物学作用。MatthiasNeid等[22]的研究证实，IGF-ⅠR能上调胰腺癌细胞上VEGF的表达，作为IGF-ⅠR两个主要下游分子的胰岛素受体底物-1和-2在促肿瘤血管新生中起到重要作用。Ritter等[23]学者报道胰岛素样生长因子2（insuline-likegrowthfactor2,IGF2）可能在血管瘤生长调节中起重要作用,该研究小组在2002年运用cDNA微集阵列分析方法发现增生期血管瘤中IGF2表达增强。他们还运用人血管瘤的外植模型，显示IGF2促进血管瘤体的外扩生长。此外，在增生期还出现了包括αvβ3（LM609）和α5β1一些血管生成相关的因子,在消退期一些IFN诱导基因表达增加。2004年,YINGYU等[24]的研究发现在增生期和消退期婴幼儿血管瘤中IGF2均高表达，但在血管畸形、淋巴管畸形及正常婴儿皮肤组织中未被检测到。2008年,ArnaudPicard等运用定量实时PCR技术，分析了3例快速消退型先天性血管瘤（rapidinvolutingcongenitalhemangioma,RICH）和5例非消退型先天性血管瘤(non-involutingcongenitalhemangioma,NICH)标本中IGF2的表达，结果显示IGF2mRNA在RICH和NICH中均有表达，相当于4岁以上年龄的婴幼儿血管瘤患者瘤体中的表达水平[2]。
3小结
婴幼儿血管瘤进展中表现的特征性使其不失为内皮细胞生物学和血管发生学研究的良好模型。了解IGF-2在血管瘤发生发展中的作用，可为血管生成机制的研究提供基础，并有利于阐述血管瘤的发病机制，为血管瘤的分类、诊断提供新的思路。目前，血管瘤的治疗方法有皮质类固醇激素或普萘洛尔口服疗法、瘤体内药物（平阳霉素/血管硬化剂/皮质内固醇激素）注射疗法、干扰素皮下注射疗法、激光治疗以及外科切除[25]。但这些治疗往往有副作用和并发症,尤其是药物治疗,如瘤体内注射血管硬化剂后出现溃疡，眶周注射皮质类固醇激素后出现视网膜动脉闭塞、眼睑坏死[26]，干扰素注射后出现发热、白细胞减少、贫血，严重时可发生痉挛性两侧麻痹（Little病）。靶向治疗将是临床药物治疗的新方向，也只有弄清血管瘤的病理形成的细胞和分子基础，这一疾病的靶向治疗才有可能成为现实。
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