【关键词】中频药物导入；玻璃酸钠注射；膝骨性关节炎
膝关节骨性关节炎是一种常见的老年慢性疾病，是由多种因素引起的以关节软骨退变和骨赘形成为主要病理特征的关节疾患，是膝关节疼痛的常见原因。随着我国人口老龄化进程的加快，骨关节炎的发病率也在逐年增高，尽管人工关节置换术能为众多的患者解除痛苦，但由于人工关节费用高、创伤大、痛苦多等原因，目前尚不能普及。几年来，西华县人民医院疼痛科采用玻璃酸钠联合中频药物导入法治疗膝骨性关节炎，临床应用效果良好。
1资料与方法
1.1一般资料本组患者167例，均符合1995年美国风湿病协会修订的诊断标准［1］。其中男74例，女93例。年龄44～76岁，平均(55.1±3.5)岁。病程3个月～15年。单膝发病121例，双膝发病46例。发病原因或诱发因素：膝关节畸形22例，扭伤13例，创伤及手术后8例，身体肥胖108例，无明显原因26例。全部病例均有膝关节疼痛，劳累后加重，休息后缓解之特点。合并有晨僵及跛行者45例，有起步疼痛及胶着现象者44例。临床检查压痛点多分布在膝关节两侧及髌骨周围。膝关节肿胀伴积液者23例，伸屈功能障碍者67例，活动有弹响及绞锁着32例，髌骨研磨试验阳性者78例。膝关节正侧位X-Ray片显示：膝关节间狭窄78例，胫骨踝间棘及关节边缘变锐65例，关节两侧骨赘形成45例，髌骨上下缘增生66例，关节内游离体2例。实验室检查：抗“O”及血沉均正常。
采用随机数字表法进行分组，玻璃酸钠注射＋中频药物导入组共有84例患者，中频药物导入组共有83例患者。两组患者在性别、年龄、病史等方面差异无统计学意义，具有可比性。
1.2治疗方法
1.2.1中频药物导入治疗(电脑中频离子导入治疗仪由南京炮苑电子技术研究所生产，型号：NPD-4AS)，25min/次，1次/d，连续治疗5周。中频药物导入液由当归、红花、伸筋草、透骨草、牛膝、羌活、防风、威灵仙、川芎、木瓜、生川乌、生草乌等中药煎制而成。
1.2.2关节腔内药物注射透明质酸采用山东正大福瑞达制药有限公司生产的透明质酸注射液(商品名施沛特)，为一次性注射包装，每支2ml,含玻璃酸钠20mg。注射部位常规消毒，在严格无菌操作下用1％利多卡因2ml局部麻醉后，行关节穿刺，有落空感后回抽无血，推注无阻力，如有关节积液，应抽尽并保留针头位置，将玻璃酸钠注射液推入关节腔内，拔针后在穿刺部位无菌敷料覆盖保护针孔，然后缓慢被动活动膝关节数次，使玻璃酸钠均匀分布在关节软骨和滑膜表面，注射1次/周，连续5次为1个疗程。治疗后嘱患者尽量减少活动，充分休息，注射治疗当天停止中频药物导入治疗。
中频药物导入组：单纯采用中频药物导入治疗。玻璃酸钠＋中频药物导入组：除采用中频药物导入治疗外，每周行玻璃酸钠注射治疗1次。两组患者在治疗期间均不进行针对骨性关节炎的其他干预措施。
1.2.3二组患者均在治疗期间限制致痛性活动，进行不负重膝关节屈伸活动及股四头肌等长收缩练习。
1.3疗效评定标准根据患者治疗前与治疗终点时症状及关节活动度总积分的降低百分率(改善率)来判断疗效，疗效分为临床控制(改善率≥95%)、显效(70%≤改善率＜95%)、有效(30%≤改善率＜70%)和无效(改善率＜30%)四级。
1.4统计学处理应用SPSS12.0软件进行分析。数据均数±标准差(x±s)表示，两组计量资料的差值均服从正态分布，采用配对t检验进行统计学比较，P
2结果
两组患者治疗前后症状、体征综合疗效、总有效率比较，均P
3讨论
膝关节退行性关节病是一种常见的以关节软骨损害为特征的慢性关节疾病，其病变常累及软骨及软骨下骨、滑膜、关节周围组织。严重危害中老年人健康，临床常见、多发，严重影响患者的生活质量，临床上越来越受到重视。对该病病因，发病机制尚不十分明确，临床治疗方法虽多，但都不彻底。近年来，以高分子透明质酸制剂为代表的氨基糖类物质作为关节软骨保护剂，用以预防和治疗骨关节软骨病的研究，开拓了骨关节软骨病治疗的新领域。实验研究已证实应用玻璃酸钠凝胶液作关节内注射，能有效地预防兔关节软骨的退变，阻止了软骨基质降解酶对基质的损害［2］。由于该制剂之分子量与滑膜液中透明质酸分子量接近，且具有良好的生物相容性，能在体内完全代谢或吸收，因此高分子量、高浓度、高粘弹性的玻璃酸钠，能提高滑液中玻璃酸钠含量，增强关节液的粘稠性和功能，减少组织之间的摩擦，缓冲应力对关节软骨的作用，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合和再生，同时透明质酸钠进入软骨基质，与某些疼痛介质结合，缓解疼痛，增加关节活动度。
中频电疗仪的中频药物导入作用是利用直流电的电场作用以及电学上“同性相斥”的原理来进行的，带负电荷的药物被直流电场的负极推动进入人体，带正电荷的药物则被正极推动进入人体。应用中频电疗仪有利于提高中药有效成分在膝关节内的渗透和吸收。中频电疗本身可有效改善膝关节局部血液循环，温通静脉瘀滞，降低骨内压力，加速新陈代谢，增加局部组织氧离子和营养成分的供给，具有消炎、镇痛的作用。
玻璃酸钠注射配合中频药物导入治疗膝关节骨性关节炎，内外结合，标本兼治，治疗效果远高于单一的治疗方法，值得临床推广应用。
功能锻炼对膝骨性关节炎的治疗及预防复发均有重要意义。尤其是病程较长的患者，股四头肌大多有不同程度的萎缩，关节稳定性较差，故要特别重视股四头肌的锻炼。长期坚持锻炼，对保持膝关节稳定，防止复发，控制病情发展十分有利。
参考文献
[关键词]人膝骨关节炎；中医；西医；治疗现状；创新治疗
[中图分类号]R274.9[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2015）15-0147-05
[Abstract]Kneeosteoarthritisfrequently-occurringdiseaseandtheelderlygroup，andreducesthequalityoflifefortheelderly，affectstheelderlypeopleinlaterlife.Basedontheconnotationofkneeosteoarthritis，byChineseandwesternunderstandingofkneeosteoarthritisresearchpresentsituationandtheanalysis，elaboratedthecommonacupuncture，traditionalChinesemedicineexternaltreatment，drugtherapy，surgicaltherapy，andputforwardinnovativetreatments.Bythestudyofkneeosteoarthritistreatmentmethod，makesthefarthemosteffectivetreatmentkneeosteoarthritis，contributetoimprovekneeosteoarthritistocure.
[Keywords]Kneeosteoarthritis；TraditionalChinesemedicine；Westernmedicine；Treatmentsituations；Innovativetreatment
人膝骨关节炎是膝关节面软骨发生结构絮乱或退变，并伴随着软骨剥脱、下骨质增生，造成膝骨关节畸形。在临床上，人膝骨关节炎表现为关节疼痛、压痛、肿胀、僵硬、畸形、不稳以及有摩擦感和活动受限。人膝骨关节炎多发生于中老年群体，降低了中老年人的生活质量，为中老年人带来严重的经济负担。
1人膝骨关节炎概述
研究人膝骨关节首先要了解什么是骨关节炎。骨关节炎又叫退行性关节病，其临床表现形式主要为僵硬、慢性疼痛、伴有关节功能障碍和肿大，其发病机制复杂。人膝骨关节炎又称增生性关节炎，是骨关节炎中最为常见的临床表现形式。主要病理表现为关节软骨面反应性增生、膝部关节软骨变性和骨刺形成。该病主要发生于中老年人群。难忍的疼痛、行动的不便严重影响中老年人的精神面貌和生活质量。膝骨关节炎是西医通过生物解剖学原理命名而成，而在中医学范畴内并没有明确的膝骨关节炎的名称。中医学多以主要症状或主要病机等命名。古代文献指出中医将膝骨关节炎称为“膝痹”。骨关节炎多发病于中老年人群，据国内外调查显示，骨关节炎的总患病率约为15%，其中以75岁以上老年人群体发病率最高，约80%。40岁人群约10%，60岁以上则达50%。而骨关节炎最终致残率为53%。疾病除了带来痛苦，还带来巨大的费用支出，不但给家庭还给社会带来巨大的负担。以我国为例，中国人口老龄化问题严重，60岁以上人口己超过1亿，据统计表明其中患骨关节炎人数约占5000万。显然，骨关节炎疾病已经成为威胁人们生活质量甚至生命的几项重要疾病之一，其预防保健己成为重大的公共卫生学问题。
2中西医对人膝骨关节炎治疗认识
2.1中医对人膝骨关节炎治疗现状
中医理论认为，膝骨关节炎多因为肝肾不足、机体衰老、腠理不密、筋骨失荣、骨髓不充、卫外不固等原因以致风寒湿邪乘虚而袭，导致经络阻滞、血脉不通闭阻关节，使膝骨关节僵硬、活动疼痛、屈伸不利最终导致膝骨关节炎的病发。中医理论中没有明确的膝骨关节名称，主要以痹证范围研究。近年来中医学对骨性关节炎治疗取得了很多进展，主要表现在对病因病机的研究和中医内治方向上的研究。骨性关节炎在中医理论研究中最早出现在《内经》中，《内经》指出：“痹，闭也。风寒湿三气杂至，合而为痹也。”这句话充分体现了膝骨关节炎发病时行动受到限制，并行动伴随着疼痛等症状。莫少庸在其《内外合治结合辨证用药治疗膝关节骨性关节炎89例》中对膝骨关节炎进行研究，将其分为四种类型，即气阴两虚型、肝肾亏损型、寒凝瘀阻型和痰湿型等。针对膝骨关节炎施以柔阴通痹汤、加味二仙汤、加味补阳还五汤治疗和痰通痹汤等，总有效率为97.75%。宏树臣在《中医指针综合治疗膝关节骨性关节炎》中从膝骨关节炎疾病病变的特点入手，将该病分三期进行治疗，即初期、中期和晚期。在初期以通经活络、活血化瘀、祛风除湿为主，配合化瘀定痛汤的使用，化解病情。中期和晚期力求补益肝肾、养血荣筋为主，佐以温经通络，理气散结。曹向阳等在《壮筋活血汤治疗膝骨性关节炎152例》中从整体上对膝骨关节炎做了研究。以壮筋活血汤治疗为主时，滋补肝阴、柔筋利节为辅进行治疗；以壮骨蠲痹汤治疗膝骨关节炎时，多用甘润之品调补肝肾，标本兼治，缓解症状，效果明显。另外，由吕建国和郑清莲共同撰写的论文《补肾活血方剂治疗膝关节退行性骨关节炎165例》中，发现补肾活血法能够延缓软骨组织的退变，消除骨关节炎的胶原老化现象。因此，以补肾活血的方法治疗膝骨关节炎可以改善机体微循环，促进软骨细胞的基质合成，改善膝骨关节炎带来的病变。
2.2西医对人膝骨关节炎治疗的认识
西医对人膝骨关节炎治疗的认识可以通过对膝骨关节炎的病因病机入手进行研究。西医认为膝骨关节炎是在生物学因素和力学因素的共同作用下，软骨下骨和软骨基质之间合成和分解代谢失衡的结果。膝骨关节炎病理改变主要表现为七个方面，即软骨下骨质硬化、关节软骨退变、骨囊肿形成、关节囊纤维化、滑膜绒毛肥大、挛缩、关节内渗液、游离体的形成以及BouChard与Heberden结节形成等。西医主要从生物学和力学两个方面因素对病理改变的机制进行论述。
2.2.1力学因素关节面有效负重面积减少或负重增加，关节软骨面上的应力增加，高应力使胶原纤维网架的物理和化学连接发生松弛，超微结构遭到破坏造成了胶原纤维疲劳性断裂。同时，关节单位面积内的骨小梁压力增高，软骨下骨小梁发生微细骨折而塌陷，软骨下骨质硬化，软骨的营养作用受到影响，导致软骨缺少滑液的与营养而发生退变导致膝骨关节炎的发生。
力学环境异常分析膝骨关节炎可分为两类：即关节过度使用和关节面吻合不良。①关节过度使用包含关节软骨负荷过大和关节软骨长期磨损。前者主要由于膝关节长期屈曲负重和过度肥胖等因素，导致关节软骨压力增大，导致关节使用过度。后者主要出现在大运动量造成关节长期严重磨损的运动员中。②关节面吻合不良。关节面吻合不良分为两种，即关节力线或关节面形状改变导致的关节面吻合不良，比如骨折畸形愈合、先天畸形等；由于关节周围稳定装置紧张或松弛造成的关节吻合不良，如老年人由于肌肉松弛造成关节面不稳等。
2.2.2生物学因素生物学因素分析膝骨关节炎首先要了解正常关节的情况。正常关节软骨呈半透明状、浅蓝白色、光滑而有光泽，传导关节负荷并耐磨损以及关节和吸收震荡等功能。主要组成成分有软骨基质和软骨细胞两种，其中软骨基质是由蛋白多糖和胶原组成，软骨细胞位于其间顺胶原纤维方向排列。
3运用多种方案治疗人膝骨关节炎
3.1中医治疗人膝骨关节炎的方案
3.1.1针灸治疗（1）针灸治疗膝骨关节炎的有效性：针灸的形成和发展是我国中医在经历了几千年的传承所保留下来的重要宝藏。在治疗人膝骨关节炎的问题上，已经取得很好的疗效。杨志琴等[1]在《足三里灸配合电针治疗膝骨关节炎34例》中，用两组针灸方法以对比的形势进行研究。第一组是用电针和足三里穴隔姜灸相互配合对人膝骨关节炎治疗。第二组是直接运用电针对人膝骨关节炎进行治疗。经过两组对昆仑、阴陵泉、主穴太溪通过实际情况增加或是减少穴位的方法施针。结果表现为第一组治疗方案有效率达94.12%，第二组为79.42%。由此可见，无论是单一使用电针针灸还是配合使用都可以达到治疗人膝骨关节炎的目的。针灸治疗膝骨关节炎不但在国内应用广泛，近年来在西方的一些国家，针灸疗法也得到广泛的推广和应用，有三万多名医生在德国应用针灸治疗骨关节炎和一些慢性疼痛。在西班牙某疼痛俱乐部、美国马里兰大学医学院、德国海德堡大学、柏林慈善大学医学中心等机构通过对针灸疗法的对比研究证明针灸疗法的显著疗效[2]。（2）针灸的特点：针灸治疗膝骨关节炎的特点主要表现在配穴的多样性和实施方法多样性等。①配穴的多样性。配穴的多样性主要是指人体穴位众多，中医根据不同患者的不同情况，配以实施不同的穴位进行施针治疗。王应军[3]在通过针灸治疗与西药治疗对比得出，针灸治疗人膝骨关节炎无论在治疗效果还是在治疗安全方面都要比西医药物效果更佳、治疗也更加安全、价格也更加便宜、无副作用，更适用于人膝骨关节炎的临床治疗。在王应军[3]的研究中所采用的针灸疗法是取膝阳关、鹤顶、双侧的血海、内膝眼、阳陵泉、膝关、外膝眼等穴位，并针对具有感到寒冷的患者采取使用艾灸的方法驱寒散痛，目的在于通过对膝关节局部的穴位施针，达到补益气血、疏通经络的效果。卢得健等是以两组分别施针互为参照进行针灸治疗的研究。分别以温针和火针对人膝骨关节炎患者进行对比治疗。经过治疗发现无论是温针治疗还是火针治疗都可以减轻人膝骨关节炎患者的病症，但火针治疗的效果要优于温针治疗的效果。医者根据患者的实际情况将患者分为肾虚髓亏型、阳虚寒凝型和瘀血阻滞型，施针的主穴选取的是阴陵泉、阳陵泉、血海、梁丘、阿是穴[4]。②实施方法呈多样性。这里是指针灸治疗方式多种多样，除了传统的针灸方式外，还有许多独特的施治方式。如李瑛等在《“冬病夏治”治未病对老年膝骨关节炎的临床运用》一文中指出在每年的三伏天对78例膝骨关节炎患者进行温针灸治疗，具体治疗方法是以每个伏的第一天为起始日期进行治疗，以每天一次的频率实施1周的时间，并在休息3d后开始下一伏的治疗。每年伏天治疗三个7d，以3年为一个疗程。研究表明，这种治疗方法对人膝骨关节炎的有效率达到88.46%[5]。由此可见，“冬病夏治”这种治疗方法在防治老年膝骨关节炎的治疗中效果尤为显著，且该方法疗效可靠、简单易行、费用低廉，是老年人首选的治疗方法，同时也为解决我国人民群众普遍反映的看病贵提出了解决措施，这已经不单是治疗膝骨关节炎方面的进步，同时也是我国医疗领域的进步。除以上的两个特点外，针灸治疗膝骨关节炎的特点还有针灸治疗配以其他治疗方法共同治疗膝骨关节炎。吸收其他方法的优越性的同时，两者互相作用，取长补短，共同为解决膝骨关节炎患者减轻病痛、根除疾病这一相同的目标做出努力。桑秀丽等以针灸配合微波治疗膝骨关节炎，根据临床症状每次选用主穴4～6个，并配合TDP照射。同时配合以微波理疗仪连续治疗两个疗程。另外，以口服西药为另一组进行两种方式对比研究。结果表明，前一种方法较后一种方法对改善人膝骨关节炎患者的病症，尤其是疼痛、肿胀等症状有显著效果，是保守治疗人膝骨关节炎的有效方法[6]。
3.1.2中药外敷当今对膝骨关节炎治疗的观念中普遍认为只要买副膏药贴于患处就可以解决问题，市面上的膏药品种也非常的多。普通市面上的中药贴只能起到普通的缓解疼痛的作用，无法真正做到根除病症。在中医临床治疗中运用敷贴法、熏洗法和热熨法等治疗方式，临床实验表明运用这几种方法治疗膝骨关节炎效果明显[7]。首先，敷贴法。敷贴法主要指将膏剂或者散剂直接敷贴在患处，通过直接渗透法将药物直接作用到患处，起到治疗作用。比如，李文庆在《骨伤风湿膏治疗膝骨关节病的临床观察》中运用骨伤风湿膏进行膝骨关节炎的治疗，有效率高达94.5%。敷贴法方便易行，患者自身就可进行治疗，减少了去医院治疗的麻烦，避免了患者因为治疗影响工作和生活[8]。其次，熏洗法。熏洗法顾名思义就是用药物熬汤熏洗患处及周边部位，同时为了加强疗效，还可以加以白酒和米醋配合使用。熏洗法具有疏通筋脉、消除肿痛、活血通利等效果，但皮肤敏感的患者则需要谨慎使用该方法。最后，热熨法。热熨法与熏洗法都是热疗的方法，熏洗法是运用药汤蒸汽作用患处，而热熨法是运用药物加热后产生的热能结合药物自身的作用对膝骨关节炎进行治疗。孔熙春曾指出“以《刘寿山正骨经验》经验方加减，用白酒拌匀，装入布袋热熨，另配合梅花针治疗膝骨关节炎，结果总有效率88%[9]。”热熨法同熏洗法一样，对皮肤敏感的患者需要谨慎使用。
3.2西医治疗人膝骨关节炎的方法
3.2.1药物治疗除以上中医对人膝骨关节炎的治疗方法外，现代西医对人膝骨关节炎也有其自身独特治疗方法。目前，最为常见的治疗方法主要是以药物为主的治疗方法。药物治疗因其使用方式简单，在最近几年对药物治疗研究进展快速、效果显著[10]。目前常用的治疗人膝骨关节炎的药物主要有以下几种：
第一，对已酰氨基酚。对已酰氨基酚对人膝骨关节炎的治疗机制目前还不是十分清楚。但是它对老年人膝骨关节炎的病症有缓解疼痛的作用，而且服用对已酰氨基酚所产生的不良反应与布洛芬相比较为轻微。因此，虽然没有明显的消除炎症的作用，却仍是治疗人膝骨关节炎的主要药物之一。
第二，非甾体类消炎药。非甾体类消炎药具有防止软骨被破坏的疗效，这主要是通过抑制前列腺素的合成而形成的治疗人膝骨关节炎的方法。但是，不是所有的非甾体类消炎药都可以进行人膝骨关节炎的治疗。许多老年人服用非甾体类消炎药会产生诸如溃疡、胃肠道不适和肾毒性等不良反应[11-14]。如阿司匹林等抑制软骨基质蛋白聚糖合成的药物不利于人膝骨关节炎的治疗被排除在外。而美洛西康、舒林酸等可以促进软骨基质蛋白聚糖合成的药物，是目前临床上较为常用的非甾体类消炎药[15-17]。非甾体类消炎药抑制软骨基质蛋白聚糖合成是通过抑制环氧化酶实现的。而环氧化酶选择性地抑制药物虽然在临床上显示可以降低不良反应的发生，但是目前有报道称此类药物对心血管系统和肾脏有不良影响。这点需要临床实验进一步的验证。就其价格来说，这类药物的使用费用高于对已酰氨基酚。因此，在目前的临床治疗中，对已酰氨基酚仍然是人膝骨关节炎的主要治疗药物。
第三，双瑞醋因。双瑞醋因作为治疗人膝骨关节炎的慢性药物，主要产生于大黄提取物，通过抑制氧自由基的产生和释放来稳定溶酶体膜的同时导致金属蛋白酶的活性被抑制[18，19]。这些机制共同运作导致关节软骨的抗炎性增强，使得关节软骨得到保护。虽然双瑞醋因是治疗膝骨关节炎的慢性药物，但是不可否认其对膝骨关节炎的治疗效果在临床上得到认可，也是临床治疗膝骨关节炎的常用药物之一。
第四，透明质酸。透明质酸首次运用到治疗膝骨关节炎是在1974年，其治疗效果显著且治疗过程和效果安全系数高。透明质酸治疗主要是通过将透明质酸注入到关节腔内，起到关节的作用。这种关节最终导致关节活动性增强，减轻关节在活动时产生的压力的同时在一定程度上缓解因为关节炎症造成的疼痛症状。与此同时，因为透明质酸的使用安全性高、副作用小，所以透明质酸在临床上的应用减少了其他药物使用产生的对心血管、肾脏等的损害，也降低了膝骨关节炎的治疗成本。
除上述几种药物外，治疗膝骨关节炎的药物还有很多。病患在选择使用这些药物时应该按照自身的具体情况选择适合的药物。
3.2.2外科治疗提到外科治疗多想到手术治疗。当前，治疗人膝骨关节炎的外科治疗是由早期针对人膝骨关节炎的病因进行预防人膝骨关节炎而产生的[20-22]。早期外科治疗人膝骨关节炎手段还不是很成熟，技术也有些落后，针对人膝骨关节炎的治疗多集中在人膝骨关节炎的晚期。发展到当今，通过众多人膝骨关节炎专家的研究，再将人膝骨关节炎通过人体力学和生物学的领域进行分析，提出了治疗人膝骨关节炎的新方法。主要表现在：第一，关节清理术。通过临床实验可以发现患有人膝骨关节炎患者的关节腔内有许多软骨碎片、炎症介质、增生的滑膜组织和钙盐结晶等。这些物质在人膝骨关节腔内势必会导致关节内部炎症的产生，造成人膝骨关节炎的产生。为了减轻患者的痛苦就要清除关节腔内多余的物质，这就需要进行关节清理术。在关节镜的作用下，将关节腔内关节软骨的碎片和其他物质清除并反复清洁关节腔内部。这种方法可以降低人膝骨关节炎带来的炎症，减轻患者的痛苦。目前手术进行关节清理术仍然存在众多的争议，临床对比实验表明，关节清理术只适用于人膝骨关节炎早期[23-25]。第二，软骨下骨钻孔。软骨下骨钻孔手术可以伴随着关节清洁术同时进行。软骨下骨钻孔手术的机制是由于机械的原因使得关节软骨破裂，造成关节内部出现出血现象和纤维蛋白导致凝块。与此同时，关节腔内滞留的未分化的细胞经过分化形成了软骨细胞，形成一种与周围软骨组织不同的软骨组织。这种软骨组织无法起正常的软骨组织修复关节表面的作用。虽然如此，但临床上一些病例表明该软骨组织经过修复可在很长时间内与正常关节面具有相同的功能，在一定程度上缓解了患者的痛苦。第三，自体软骨细胞移植。自体软骨细胞移植是通过选取自身的软骨标本进行体外培养的方式培育软骨细胞。在进行手术的时候，通过手术清洁关节腔中病变，并依据关节腔内关节软骨的破损情况选择合适的骨膜并将其缝合在缺损软骨的周围。最后，利用将所培育的软骨细胞植入到骨膜下的方式完成整个手术。第四，自体骨软骨移植。自体骨软骨移植手术是在关节镜的协助下，从自身体内移植软骨到小于2cm的软骨破痕中。因为移植的是自身的软骨，因此很容易保留透明软骨的特征。经过临床验证，自体骨软骨移植手术成功有效率达九成以上。
3.3创新疗法
除了传统治疗方法，现代医学结合基因技术和生物科技提出了长期服用硫酸氨基葡萄糖、基质金属蛋白酶抑制剂、抑制炎性细胞因子和基因治疗等创新疗法。长期服用硫酸氨基葡萄糖可以补充软骨滑液的不足，预防膝骨关节的结构改变，能快速地缓解症状，促进软骨代谢。使用基质金属蛋白酶抑制剂是近年来针对MMPs和TIMP研究力图关节软骨受到降解酶的作用而破坏的情况。临床和动物实验表明，基质金属蛋白酶抑制剂可有效降低关节软骨受到降解酶破坏情况，缓解病症，减轻患者疼痛。抑制炎性细胞因子是指抑制膝骨关节炎病理的主要因子，主要指控制细胞因子，调控细胞的活性，以达到预防和治疗膝骨关节炎的目的。最后是运用基因治疗膝骨关节炎。目前基因治疗方法还处于动物实验阶段，以求通过转基因的方法提高患者自身的抵抗力。通过基因片段加在膝骨关节上，以在根本上改变膝骨关节病变基因，达到根除膝骨关节炎病症的目的。虽然基因疗法还处在实验阶段，但动物实验表明该方法可行性高，治疗效果好，值得更多患者期待。
除上述的几种膝骨关节炎的治疗方法外，还有中西医结合法、手术治疗法等多种方法。由于目前膝骨关节炎发病的病因和病机仍然不是很明确，虽然有多种多样的治疗方法，但单一的方法还是不能完美根除膝骨关节炎病症。因此在临床治疗时，医生多采用综合性的治疗方法，集各家所长，以目前为止最为有效的方法治疗膝骨关节炎。膝骨关节炎降低了老年人的生活质量，研究膝骨关节炎的治疗方法已成为解决我国民生大计的重要内容之一。因此，研究人膝骨关节炎的治疗现状和方案具有重要的意义。
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【关键词】脂肪源干细胞海藻酸钙软骨
Abstract:［Objective］Toevaluatetheeffectofnotinducedadiposederivedstemcells(ADSCs)withcalciumalginatehealingfull-thicknesscartilagedefectsofrabbitkneeafterthemodelwasmadeincenteroffemoralfaciespatellarisartificially，inordertofindasimpleandworkingwayofarticularcartilagedefectrestoration.［Method］Twenty-sevenNewZealandwhiterabbitswerepidedintoA，B，Cgroupsrandomly.CalciumalginatewastransplantedtocartilagedefectpositionofrabbitsofgroupA，nothingforgroupBandcalciumalginatewithnotinducedADSCsforgroupC.Theanimalswerekilledin4th，8thand12thweeklater.Restoredtissuewasevaluatedusingnakedeyes，histologicalsectionandtransmissionelectronmicroscopy，scorewasgivenaccordingtomodifiedWakitanigradestandard.ThetotalscorewasanalyzedwithstatisticsoftwareSPSS11.5.［Result］ArticularcartilagedefectsoftheanimalofgroupsAandBwerefilledwithfibroustissuewhichcontainsprotofiberwhenitwascheckedusinghistologicalsectionandmicroscopy.Thedefectwasfiledwithchondrocyte-liketissue.Chondrocyte-likecellssurroundedwithlacuneswereobservedinhistologicalsection.Plentyofcollagenfibersaroundcellscouldbeseenundertransmissionelectronmicroscopy.GroupChadasignificantstatisticaldifferencecomparedwithgroupsAandB(P
Keywords：ADSCs;calciumalginate;cartilage
关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年ZukPA和ZhuMin［1］等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adiposederivedstemcells，ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1主要仪器
(1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(NikonTE2000，日本)；(4)50ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。
1.1.2主要试剂
(1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2)Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。
2实验方法
2.1脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定
将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10ml，用2倍体积D-Hank’s平衡盐液漂洗3遍，剪成1mm×1mm×1mm大小，加入0.2%Ⅰ型胶原酶5ml置于37℃温箱内消化0.5h，低温高速离心机内1000r/min离心10min弃上清，加入160mmol/LNH4Cl约5ml裂解红细胞10min，筛网过滤，按8000个/cm2种植于50ml培养瓶中。培养瓶置于37℃体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔2～3d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μmol/L维生素C，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。
2.2动物实验
选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.5～3.5kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106／ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5d。
2.3检测方法
2.3.1细胞学检测
生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VonKossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。
2.3.2修复组织检测
分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。
2.4统计学分析
根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分
3结果
3.1脂肪源干细胞培养及诱导
细胞于接种后24h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，3～4d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红O着色（图2），可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VonKossa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色（见图3），说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。
3.2大体观察
术后3～4d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。
术后4周，A、B组缺损处修复组织基本相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。
术后8周，A、B组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。
术后第12周，A、B组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊（图4）。
3.3组织学观察
术后4周，A、B组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；C组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规则，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样结构，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。
术后第8周，组织学与第4周相似，A、B组缺损区有纤维组织覆盖，有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；C组修复组织中可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，类软骨陷窝多见，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。
术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成，甲苯胺兰染色少而不均匀；C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规则，类软骨细胞周围可见类软骨陷窝（见图5），未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。
3.4透射电镜观察
透射电镜下可见藻酸钙凝胶孔径大，交联较紧密、壁厚。A、B组4周可见到缺损处有较多的红细胞，8、12周缺损由纤维组织充填，多为层状排列的纤维组织，4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解；C组8、12周，修复组织中可见类幼稚软骨细胞，细胞呈圆或椭圆形，表面有不规则的突起，胞质中可见丰富扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维(图6)。4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解。
3.5统计软件分析结果
脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物移植组得分与其他两组相比各时期有显著性差异(P0.01)。（见表2）表2组织学评分时间
4讨论
关节软骨是一种高分化的组织，其自行修复后一般为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的能力有限。软骨细胞移植可形成透明软骨修复［3］，但缺点是软骨细胞本身是高分化细胞，体外培养增殖能力有限，自体移植其取材过程也会对受损的关节产生额外的损伤并需要二次手术，过程繁琐且费用昂贵［4］。
组织工程技术为软骨缺损的修复带来了希望。骨髓基质干细胞的发现及其相关软骨组织工程应用研究较早，但骨髓基质干细胞取材、培养、诱导及移植相对较为麻烦，经济效果和临床效果也不理想。在体外培养条件下，脂肪源干细胞表现出与骨髓基质干细胞相类似的分化能力，而且具有易获得性、可迅速扩增及多向分化潜能等特点。本实验中，所培养的脂肪源干细胞，取材容易，培养、扩增效率较高，具有分化潜能，是优势较大的种子细胞。
当脂肪源干细胞在体外用软骨培养基培养时，能够被诱导成软骨系，组织学和组织化学明显显示软骨细胞的表型。在软骨源分化过程中有特征性分子如II型胶原、软骨寡聚蛋白和软骨蛋白聚糖表达，体外诱导和体内形成的软骨低水平表达X型胶原和I型胶原［5］。12周左右，C组修复组织为类软骨组织，透射电镜照片可见大量基质，也观察到了类似组织学结果。
DragooJL等［6］将脂肪源干细胞向软骨方向诱导后复合纤维凝胶移植到兔股骨髁全层软骨缺损处，结果显示修复效果较为满意。本实验的主旨是，由于不能判定诱导后植入，体内的真实生理环境是否会再次对经过诱导的细胞发生作用，与其通过人工的方法诱导后移植，增加了支出和过程的繁琐，不如省却人工模拟诱导的过程，将单纯细胞直接植入关节软骨缺损处，在转归过程利用真正的生理环境诱导分化，或许更能接近真实的修复。如果修复效果满意，将为软骨组织工程修复软骨缺损提供较为简单的方法。本实验中，脂肪源干细胞在植入前特意未进行软骨方向分化的诱导，而仅在证明其具有干细胞特性后，与藻酸钙凝胶混合后直接植入缺损处，最终所得的结果与DragooJL等的大体一致，这就提示，真实的生理环境诱导同人工诱导后植入差别不大。但因两种实验方法如造模及评价方法有些差别，是否的确如此，有待后继大规模动物对照实验进一步验证。图1培养的脂肪源干细胞24h后贴壁，态呈长梭形、三角形或多角形。倒置相差显微镜×200图2培养的脂肪源干细胞爬片做油红0染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红0着色。右上角为阳性对照。苏木素油红0染色×200图3成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VonKossa染色，形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色。VonKossa染色×100图4术后12周大体观察，A、B组缺损多完全填充，为纤维组织状物基本覆盖，C组修复组织类正常关节软骨，与周围正常软骨组织界限模糊图5术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞。图中箭头示为原缺损处。HE染色×200图6术后12周，C组修复组织中可见类幼稚软骨细胞，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维。透射电镜×4200
藻酸钠是从海藻中提取的线状多糖成分，与软骨基质中的蛋白多糖结构相似［7］。藻酸盐与钙离子等二价阳离子交联后可形成网格状结构的多孔材料，常呈胶冻样凝胶，作为可注射性支架材料常用于填补组织缺损，并作为细胞载体运用于组织工程。藻酸钙凝胶在生物体内通过酶解生成葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸单体，对机体无毒性，无免疫源性，具有良好的生物相容性。有实验结果表明，脂肪源干细胞在藻酸盐支架中向软骨方向诱导后，其与脂肪源干细胞表现出良好的兼容性［8］。在本实验中，6周左右，藻酸钙凝胶即完全降解，组织切片未见明显炎性细胞浸润，藻酸钙植入后，4～6周左右时已大部分分解，提示其作为组织工程载体具有良好的应用前景。同时实验中也观察到，并非所有C组的动物软骨缺损处都达到完全修复，原因有待进一步探究。
总之，脂肪组织在体内含量大，取材简单，利于脂肪源干细胞收集，又兼该细胞易于扩增，故脂肪源干细胞对于软骨缺损修复相关的软骨组织工程来说，是一种非常有希望的种子细胞。从脂肪源干细胞被发现并证明其具有多向分化潜能以来，随着时间的发展和相关研究的不断深入，脂肪源干细胞向软骨方向诱导技术已经成熟，其相关软骨组织工程研究的体内、体外实验效果都较为理想［6、8］，为软骨缺损的治疗提供了新的途径。但现有文献记载的相关动物实验中，其体内观察时间较短，远期修复效果有待进一步研究。本实验结果最终提示，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植修复关节全层软骨缺损近期效果也较为理想，对于关节软骨缺损修复是一种很有希望的简单有效的组织工程方法。
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【摘要】：目的通过建立大鼠膝关节前交叉韧带切断骨性关节炎（OA）动物模型，探讨该模型中软骨及软骨下骨病理变化。方法取SD大鼠30只随机分成3组（术后2、6周和10周组）。每只大鼠右膝行前交叉韧带切断，造成膝关节不稳定动物模型，对侧为假手术侧。分别将每组动物于术后2、6和10周处死，取胫骨近段，比较各组骨关节大体形态及病理变化。光镜下观察指标有改良的Mankin评分、骨组织形态计量学参数。免疫组化法观察MMP-13在软骨细胞中的表达。结果在造模后2、6周和10周软骨退变呈进行性发展。Mankin评分增高、MMP-13表达逐渐增强，与假手术侧相比有统计学意义（P＜0.01）。软骨下骨形态计量学分析显示，造模后早期软骨下骨骨量轻度减低（P＜0.05），之后骨量逐渐增加（P＜0.01）。结论大鼠的前交叉韧带切断能够造成动物膝关节OA样改变，表现出软骨下骨吸收、骨重建的变化特点。
【关键词】骨性关节炎；动物模型；软骨下骨；基质金属蛋白酶13
Abstract：ObjectiveToestablishanosteoarthritismodelinratkneesbytransactinganteriorcruciateligament，andcharacterizingsubchondralboneremodeling，cartilagedamageduringthediseaseprogressioninthemodelsofsurgicallyinducedOA.Methods30ratswerepidedintothreegroup(2weeks、6weeksand10weekspost-surgerygroup).Rats'rightkneejointsweresubjectedtoanteriorcruciateligamenttransection(ACLT)，whiletheleftkneeservedascontrol.Ratsweresacrificedandthetibilplateswereharvestedwhichwerestudiedinbothgross-morphologicalandpathohistological，atthesametimeCoimmunostainingformatrixmetalloproteinase13(MMP-13)wasperformedtoinvestigatetheprogressionofcartilagedegradetion.ResultsThedegenerationofarticularcartilageofthesurgerykneesgotworsebytime.surgerykneesMankin'sscoresandMMP-13expressionsweresignificantlyhigherthanthoseintheshamknees(P＜0.01).Histomorphometricanalysisrevealedsubchondralbonelosswithin2weekspostsurgery(P＜0.05)followedbysignificantincreasesinsubchondralbonevolumerelativetoshamupto10weekspost-surgery(P＜0.01).ConclusionWACLTonratscaninduceOsteoarthriticchangeswhichinvolvecartilageandsubcondralbone.Thismodelhavethemeritsofeconomical，convenientandshort-terming.
Keywords：osteoarthritisOA;animalmodel;subcondralbone;matrixmetalloproteinase13
动物模型是研究骨性关节炎（osteoarthritis，OA）病理机制、治疗及预防的重要手段之一。目前OA的动物造模方法有多种，目的是最大程度地模仿人类OA的病理生理过程。本实验通过建立大鼠膝关节不稳定OA动物模型，并观察其软骨及软骨下骨的病变特征，以期进一步了解OA的病理过程及发病机制。
1材料与方法
1.1主要试剂及材料
兔抗鼠基质金属蛋白酶13（matrixmetalloproteinase13，MMP-13）单克隆抗体购自美国Santacruz公司，羊抗兔二抗EnVision购自上海基因科技有限公司。过碘酸雪夫氏（PeriodicAcidSchiff）及阿辛兰(AlcianBlue，AB-PAS)染色试剂盒购自福州迈新公司。SD大鼠由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.2模型制做
取20周龄健康SD大鼠30只，雌雄不限，体重400～450g，无关节病变。将所有大鼠随机分为3组：术后2、6、10周组，每组10只。6.5%水合氯醛按100mg/kg大鼠腹腔注射麻醉，备皮。模型侧：取右膝关节内侧长约0.8cm切口，沿髌韧带内侧缘进入关节腔，找到前交叉韧带，用眼科剪剪断，生理盐水冲洗，依层缝合，术中不损伤软骨面。假手术侧：同时取对侧膝关节，入路同前，打开关节腔暴露前交叉韧带，冲洗，关闭切口。大鼠术后不做任何处理，分开饲养，自由活动及进食，每日强迫大鼠活动1h。
1.3取材及标本处理
分别于术后2、6、10周将动物断颈处死，取膝关节上下各2cm区域的组织，去除皮肤，置于4%多聚甲醛液中，4℃下固定24h，固定后标本剔除周围软组织及韧带，PBS充分浸洗，流水冲洗2h，15%的EDTA液加微波脱钙2周，流水冲洗24h，只留胫骨部分，将其沿冠状面分为3等份。修整组织块后石蜡包埋，作冠状面不连续切片，每个标本切9张，间隔100μm。各取3张分别行HE、AB-PAS、MMP-13免疫组化染色。
1.4大体观察
取材时对新鲜标本的外观在肉眼及解剖显微镜下进行大体观察。
1.5组织学评分
所有组织切片经HE及AB-PAS染色后，采用盲法由两名病理医师对组织结构进行详细的观察。每张切片选择5个不同的视野，主要观察大鼠术后不同时间膝关节软骨及软骨下骨的病理改变；并参照Mankin改良的关节软骨病理评分标准［1］进行积分统计，满分14分。
1.6软骨下骨形态计量学指标
HE切片在Olympus显微镜下（40×）用Olympus图像采集系统在软骨下松质骨内随机取5个视野，用imageproplus图像分析系统(Version6.0，MediaCybernetics，SilverSpring，MD)行骨组织形态计量分析。测量参数为骨体积(BV/TV)，即测量范围内骨小梁体积占全部骨组织体积的百分比，为骨小梁面积／（髓腔＋骨小梁面积）×100%，反映骨小梁分布密度。每样本各视野相加取平均值。
1.7MMP-13免疫组化染色
切片常规脱蜡入水，过氧化氢封闭，枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波法修复抗原，加1∶200兔抗鼠MMP-13单克隆抗体(美国Santacruz公司)，4℃孵育过夜，PBS洗，加EnVision二抗，室温孵育30min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，二甲苯透明，封片。阴性对照用PBS代替一抗。结果判定：每张切片由2名病理科医师独立观察具有代表性的5个高倍视野。每个高倍视野计数100个细胞，取观察结果的平均值进行计算，计数阳性细胞的百分率，阳性指数=(阳性细胞数／所计数细胞总数)×100%。阳性指数0～10%为（-），10%～25%为（±），≥25%为（＋），≥50%为（++），≥75%为（+++）。
1.8统计学方法
实验数据采用均数±标准差表示，用SPSS11.5统计软件，计量资料行方差分析，等级资料采用非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1大体观察结果
假手术侧：膝关节软骨、滑膜外观基本正常，软骨呈蓝白色，色泽明亮，微透明，表面无充血，无裂纹及软化。模型侧：2周组中有4只膝关节胫骨内髁软骨失去原有光泽，透亮度减低，灰白，无溃疡，无裂纹。6周组，滑膜增生明显，软骨失去原有的光泽，灰白暗淡，不透亮，表面粗糙，内侧胫骨平台更明显，个别有裂隙及小溃疡，未见明显骨赘。10周组，内侧胫骨平台关节面粗糙不平，内侧胫骨平台较外侧低，表面可见溃疡糜烂，关节周缘结缔组织增生，并可见骨样增生（图1，见封3）。
2.2光镜下观察组织学变化
模型侧的关节软骨病损在术后随时间呈进行性发展，且内侧胫骨平台病变较外侧显著。各时间点Mankin评分见表1。2、6、10周时假手术侧与模型侧评分差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。表1不同时间点的模型侧与假手术侧的
软骨Mankin评分比较（略）
假手术侧大部分为正常关节软骨。HE染色见表层光滑、平整，软骨细胞分布均匀，序列整齐，层次清楚，无簇集软骨细胞，潮线完整；AB-PAS染色均匀，无失染。
模型侧术后2周:细胞排列规律性尚在，偶见少量细胞簇集现象。
模型侧术后6周：中度软骨损伤为主，软骨表面粗糙、表层裂隙，部分出现少许钙化层裂隙；但软骨基质内无明显纤维化；所有标本均出现细胞数目的变化，细胞散在增生和巢状增生，簇聚细胞出现频率增加；部分出现潮线不清晰和中断；AB-PAS染色不均匀。
模型侧术后10周：以重度软骨损伤为主，软骨表层出现较大缺损区，细胞排列紊乱，软骨细胞层次不清，细胞数减少，潮线消失，部分出现软骨全层缺损，钙化层难以分辨，AB-PAS染色大部分层次失染，伴软骨下骨硬化（图2，见封3）。
2.3骨形态计量学分析
大鼠胫骨内侧髁软骨下骨组织计量学分析数据见表2，各组大鼠软骨下骨体积分数差异有统计学意义(P＜0.01)；2、6、10周时模型侧与假手术侧相比差异均有统计学意义(P＜0.05或0.01)；模型侧6、10周时分别与2周时比较差异有统计学意义（P＜0.01）；模型侧10周与6周比较差异有统计学意义（P＜0.01），图2，见封3。表2假手术侧与模型侧不同时段软骨下骨体积（略）
2.4MMP-13在软骨细胞中的表达
（表3）表3假手术侧与模型侧不同时段MMP-13在软骨细胞中的表达结果（略）
假手术侧：大部份样本未见软骨细胞表达，少量偶见单个细胞弱表达。
模型侧：2周时在软骨中有极少量软骨细胞弱表达，与假手术侧相比阳性指数差异无统计学意义(P＞0.05)；6周时表达量增高，分别与2周时和假手术侧相比阳性指数差异有统计学意义（P＜0.01）；10周时表达量最高，分别与假手术侧及2、6周模型侧相比阳性指数差异有统计学意义(P＜0.01)，图5、见封3。
3讨论
目前OA动物模型诱导方式以关节内手术途径较为流行［2］。通过膝关节内侧半月板切除、前后交叉韧带切断等，使关节各结构的动态平衡失调，内在的生物力学性能改变，从而出现OA的病理表现。我们的研究采用大鼠膝关节前交叉韧带切断（ACLT）且动物体重较大（400～450g），这是因为体重与OA的发生发展相关［3］，大体重可以增加关节的负荷，尤其在关节不稳时使关节承受的异常负荷增加，从而提高造模的成功率。本实验发现术后早期（2周）关节软骨即开始出现少量簇聚的软骨细胞和单个肥大的软骨细胞；至中期时（6周）软骨中、深层细胞排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞，潮线断裂，深层肥大软骨细胞增多，软骨蛋白聚糖丢失；术后10周时，软骨表层出现较大缺损区，细胞排列紊乱，软骨细胞层次不清，潮线消失，部分出现软骨全层缺损，蛋白聚糖进一步丢失。DaubsBM等［4］在狗的膝关节OA模型中也观察到类似的病理变化过程。
在OA的病理过程中，关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶（MMPs），打破了MMPs-TIMP(组织金属蛋白酶抑制剂)的平衡，造成对关节软骨细胞外基质的过度降解，是软骨逐渐出现溃疡、缺失等一系列退变表现的重要原因［5］。其中MMP-13可以在胶原纤维的三螺旋区裂解胶原纤维，对Ⅱ型胶原的活性最强。关节软骨基质中的胶原90%～95%是Ⅱ型胶原，所以观测MMP-13在OA软骨破坏过程中的表达尤为重要［6］。在此模型中观察到MMP-13在术后2周时表达不明显，到6、10周时表达明显增强，且软骨下骨破骨细胞中也见表达。说明MMP-13与OA的病情发展密切相关，可以反映出OA软骨的退变程度。
软骨下骨的结构、生物力学性能及生物学方面的变化与OA密切相关［7］。软骨下骨转换的增加及之后软骨下骨的硬化被认为与OA的进展相关。因此评价软骨下骨改变骨体积有利于全面了解OA的病理变化过程。BotterSM等［8］在大鼠骨关节动物模型中用micro-CT三维成像技术纵向观察造模处骨组织的变化4周，发现在模型早期软骨下骨小梁变薄，小梁间的连接变少，体积亦减小。在HayamiT等［9］的研究中也发现OA早期软骨下骨量减少，骨转换速率加快，骨吸收大于骨形成。随着病程的发展，骨重建骨量增加，软骨下骨硬化，骨赘形成。我们在此OA模型中发现，2周时在软骨尚未出现明显组织学变化之前，软骨下骨小梁体积减小，骨小梁变薄，呈现出轻度的骨吸收。表明在OA早期，软骨下骨转换活跃，骨吸收大于骨形成。6周时，软骨下骨量明显增加，10周骨量进一步增加，即有继发性的骨增生骨质硬化。软骨下骨改变与OA的发生发展密切相关，在OA的发生发展中起重要作用，抑制软骨下骨的异常骨转换可能减缓OA进展［10］。
总之，该模型能模拟出OA随时间进展的基本病理过程，复制出骨性关节炎软骨退变过程，以及软骨下骨吸收、骨重建的变化特点，且具有造模周期相对短、经济、操作简便等优点，为下一步以软骨下骨为目标进行干预实验打下了基础。
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【关键词】关节
摘要：目的：制作不同程度关节软骨损伤的动物模型，对关节软骨损伤后软骨再生修复的组织学及超微结构进行系统研究。方法：选用1岁龄健康Leghorn鸡20只，随机分四组。甲组：切取左侧髋臼3×4mm全层软骨,再植回原处固定；乙组：切除左侧髋臼3×4mm全层软骨；丙组：切除左侧髋臼6×8mm全层软骨；丁组：切除左侧全部髋臼软骨。健康右侧髋臼为对照组。饲养7个月，一次宰杀，行肉眼、光镜、电镜观察。结果：甲组髋臼软骨损伤处完全修复；乙组软骨缺损区为纤维软骨再生修复；丙组与丁组髋臼软骨缺损区主要被纤维组织充填。结论：我们认为关节软骨再生修复能力有限，关节软骨再生修复程度与关节软骨损伤程度、有无关节软骨缺损以及关节软骨缺损程度密切相关。
关键词：关节软骨；损伤；再生修复
HistologyStudyintheRegenerativeRepairofArticularCartilageInjury
Abstract：Objective：Wesetseveralanimalmodelswitharticularinjuryinvariousdegreesandstudiedsystemicallyonthehistologyandultra-microscopicstructureofcartilaginousregenerationafterinjury.Method：20healthyleghornchickensof1.yearoldweredividedrandomlyinto4group.IngroupA3×4mmwholelayersofacetabularcartilageswerecutoutandthenreplantedtotheiroriginalsitesandfixed.IngroupB3×4mmwholelayersofacetabiularcartilageswerecutout.IngroupC6×8mmwholelayersofacetabularcartilageswerecutout.IngroupDallacetabularcartilageswerecutout..Acetabuliaonhealthysideswereconsideredasthecontrolledgroups.7monthslaterallthechickenswerekilledandtheiracetabularwereexaminedwithnakedeye,opticalandelectronicmicroscope.Result：TheacetabularinjuriesingroupArepairedcompletely;regenerativerepairoffibrouscartilagesoccurredintheinjuryareaingroupB;thedefectiveareasofacetablarcartilagesingroupCandDweremainlyfilledwithfibroustissue.Conclusion：Wethoughttheabilityoftherepairofinjuredarticularcartilageswasnotunlimited.Thedegreeofregenerativerepairofarticularcartilageswasinverselyproportionaltothedegreeofarticularcartilageinjury,thecartilaginousdefectsandthedegreeofthedefects.
Keywords:Articularcartilage；Injury；Regenerativerepair
由各种原因引起的关节软骨损伤甚至缺损导致关节功能障碍是骨科的常见问题。资料表明由于关节软骨无血管、神经及淋巴液供应，关节软骨损伤后再生修复困难。为此我们制作了不同程度关节软骨损伤的动物模型，对关节软骨损伤再生修复的组织学及超微结构进行了系统研究，为临床工作提供依据。
1资料与方法
1.1实验动物与分组:选用1岁龄健康Leghorn鸡20只，雌雄兼有，体重1.4+0.11kg，随机分四组，用甲氧氟烷开放吸入麻醉，①甲组：麻醉生效后，手术显露左髋关节脱出股骨头，切取髋臼顶部3×4mm全层软骨，再植回原处用3～0尼龙线间断缝合固定。将股骨头复位逐层缝合。②乙组：切除左侧髋臼顶部3×4mm全层软骨深至松质骨。③丙组：切除左侧髋臼顶部6×8mm全层软骨。④丁组：切除左侧髋臼全部软骨。以右侧髋关节位自身对照组。术后均未行外固定，饲养7个月观察结果。
1.2观察方法:①大体标本观察：饲养7个月，所有实验动物一次性宰杀，肉眼观察关节软骨颜色、质地、关节面光滑程度。②光镜：用20%中尔马林固定标本、做HE和PAS染色后光学显微镜观察。③电镜：扫描电镜观察超微结构的改变。
2结果
2.1实验动物术后一般情况：各实验动物术后1周内左下肢跛行，不愿行走。术后10d手术切口一期愈合。有2只实验动物不明原因死亡，另取2只动物按上述实验方法补充。
2.2大体标本观察结果：①甲组：手术左侧髋臼内表面软骨的颜色、形态、弹性及表面光滑度与对照组无差别。②乙组：切除3×4mm的髋臼软骨缺损区已有类似于软骨再生组织充填，中央部略凹陷，边缘与关节软骨结合较好，光滑度佳，形态及颜色基本与对照组相同，弹性略差。股骨头无形态改变。③丙组：手术左侧髋臼软骨缺损区内表面凹陷，表面为灰白色、质地较软的不透明组织覆盖，并与股骨头有少量软组织粘连，与软骨缺损区接触的股骨头关节表面不平。④丁组：髋臼与股骨头广泛软组织粘连，髋臼内表面为灰白色软组织覆盖，股骨头表面凸凹不平、轻度变形。
2.3光镜观察结果：①甲组：其软骨损伤处的组织学特性与对照组相同，具有典型的关节透明软骨结构，层次清晰，分表层、移行层、辐射层、软股骨质钙化层，软骨下“潮线”清晰，未见软骨退化现象。②乙组：关节软骨缺损区的再生填充组织表面微薄层的纤维组织向深层逐渐移行为纤维软骨，软骨陷窝清晰，5～8个软骨细胞聚集成的同源细胞群在基质中均匀分布，软骨细胞呈圆形、数量多，排列与关节面平行。③丙组：切除6mm×8mm的关节软骨缺损区主要被纤维组织充填，大量的成纤维细胞与关节面平行。纤维组织中散在较大的软骨细胞团，幼稚软骨细胞数目多、染色深、间质少，靠近骨组织的软骨细胞团，软骨细胞数量多、基质少，软骨陷窝不清。
2.4电镜观察结果：①甲组：其软骨损伤区扫描电镜显示与对照组相同,为正常的透明软骨,表层软骨细胞较扁,质膜有段突起，具有光滑、完整的核膜，基质中含大量与关节面平均的由胶原纤维构成的纤维束，胞质中内质网与高尔基体不发达，缺乏线粒体。移行层细胞呈卵圆形，质膜有较长突起，胞质中存在大量线粒体，大多数细胞的胞质中存在胶原纤维，高尔基体中有胞质小泡。有的小泡充满颗粒性电子致密物质，细胞质中致密体存在。辐射层软骨较大，质膜有较多突起，内质网和高尔基体发达。②乙组：软骨缺损区修复再生组织表层为大量由胶原纤维构成的纤维,与关节面平行，纤维束间存在成纤维细胞，向深层逐渐转变为纤维软骨，其软骨细胞与对照组移行层软骨细胞特征一致，区别在于基质中含大量的由胶原纤维构成的纤维束交叉或平均排列，基质含量少，软骨细胞质中除粗面内质网和高尔基体发达外，胞质小泡增多，多数小泡充满颗粒性电子致密物质。纤维组织与软骨间的移行区域的细胞特征介于成纤维细胞与软骨细胞之间,软骨陷窝清晰。③丙组：软骨缺损区的填充组织以纤维组织为主。在与正常软骨接触处及纤维组织中存在由幼稚细胞软骨组成的软骨细胞团增殖活跃，质膜突起较多，质中内质网和高尔基体明显扩张，线粒体数目增多，胞质小泡明显多于对照组，小泡中存在颗粒型电子致密物质，基质含量少，基质中胶原纤维含量介于透明软骨之间。④丁组：髋臼内表面完全由纤维组织覆盖，少量的软骨细胞聚集成团，其软骨细胞处于幼稚状态，其特征与丙组再生的软骨细胞相同，有蜕变的软骨细胞存在，外形不规则，细胞核致密，核膜上完整，胞质中亚细胞结构不清楚。
3讨论
3.1关于动物模型：选用鸡制作实验动物模型有许多优点［1，2］：鸡是双下肢行走，负重特点与人髋关节有许多相似之处，且接受实验的肢体始终负重，避免四足动物抬起患肢而三足行走，对实验结果造成影响。另外对侧髋关节作为自身对照组，符合统计学上设立自身配对的实验要求，可比性强。
3.2软骨损伤的再生修复：Sheldon认为软骨受伤后，如果软骨细胞保存完好，软骨基质可以迅速再生成。本实验甲组动物切取髋臼顶部3×4mm全层软骨后，又植回原处牢固固定，经7个月修复，肉眼，光镜、电镜观察与正常关节结构特征无差异。我们认为关节软骨损伤后，只要早期给予可靠的、较长时间的固定，可以完全愈合，不会对关节功能产生不利的影响。在软骨细胞被破坏时，此软骨细胞虽然不能再生，但可以在软骨再生过程中起诱导作用［3］。关节软骨损伤,缺损或部分切除后不能独自再生，而是由新生的纤维组织中的成纤维细胞变圆，在其周围形成包裹、并逐渐转化为新的软骨细胞［4］。此种化生过程可以在机械作用条件下产生，特别是在压力与摩擦相结合的部位。戴金炉、朱通伯［2］也认为关节面的相互接触是影响软骨再生的重要因素。本实验乙组动物髋臼软骨切除区为3×4mm，面积较小，经7个月修复，软骨缺损区由纤维软骨覆盖，中央部略凹陷，边缘与正常关节软骨结合较好，这证明由纤维组织化生转变为纤维软骨是一个缓慢的过程；而软骨缺损区四周正常的软骨组织，参与软骨再生修复过程比化生过程快。本组实验丙组与丁组髋臼软骨缺损区的充填再生组织中的幼稚软骨细胞团明显多于丁组。而且丙组及丁组实验侧的髋关节与软骨缺损区相接触的关节表面凸凹不平，证明关节软骨缺损后其再生修复能力与关节软骨缺损面积有关。如果关节软骨缺损面积较大或完全丧失，通过自身修复的机会很小，且对整个关节结构及功能产生不可逆转的影响，必须采用软骨移植，软骨膜或骨膜移植［5，6］才能获得较满意的关节软骨的再生修复。我们认为关节软骨损伤再生修复能力有限，关节软骨的再生修复程度与关节软骨的损伤程度、是否有软骨缺损及关节软骨缺损的面积呈反比例关系。
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1HA在骨关节炎(osteoarthritis，OA)治疗中的应用
OA是一种由于关节软骨退行性病变引起的中老年常见疾病，症状包括关节疼痛、功能障碍、关节畸形等。OA的关节宏观改变包括关节软骨的破坏、骨赘形成和骨-软骨接头的损伤。采用黏度补充疗法，即关节腔内注射HA能够提高关节滑液的黏弹性，部分恢复其性和减震性质，还能显著降低关节结构的恶化速度［1］。在OA的退化进程中，HA可通过抑制软骨基质蛋白聚糖聚集物的降解与增强蛋白聚糖及软骨细胞胞外基质的合成，发挥关节保护和抗炎效果［2-3］。HA能够降低炎症关节的伤害感知活性［4］，减轻关节疼痛［5］，并通过减少活性氧自由基、炎症介质和基质降解酶来保护软骨［2］。
关节腔内注射HA已广泛用于膝OA的治疗。凌沛学等［6］报道了国内近60家医疗单位对HA疗效的临床评价，肯定了HA在膝OA治疗中的有效性。临床多为每周给药1次，3～7周为1疗程。评价指标为严重度指数、关节疼痛、关节伸展度、晨僵、关节积液以及止痛药的摄入量等。患者注射2～3次后，症状获得明显改善。对关节疼痛的缓解最为明显和迅速，其次是关节活动度的改善。疗效与患者的严重度和病程具有相关性，对严重度较高的患者疗效较差。多数临床结果表明，HA具有较好的耐受性，未见明显的不良反应。少数资料报道的不良反应多局限于注射部位，如疼痛或肿胀，极个别的患者出现头痛和发烧等症状。不良反应常发生于注射后1～3d内，患者一般能够耐受，不需处理，2～3d内可自行消失［3］。
HA在髋、肩、踝和手OA中的应用也呈上升趋势。重度髋OA患者1周1次，连续3周接受HA治疗后，其疼痛和残疾评分显著降低，效果可维持至治疗后6个月［7］。HA在踝OA中的应用相对较少。Migliore等［8］对多种HA产品在踝OA中的应用进行了总结。临床试验结果显示，HA应用于踝OA的治疗是安全、有效的。肩、手部位的OA应用黏度补充疗法也能有效地缓解疼痛、改善关节功能［9-10］。
非交联HA在关节中消除较快，半衰期为20h左右［11］，因此临床使用1疗程需要持续3～5周，1周注射1次。交联HA关节腔注射剂在保留了HA良好的生物相容性的同时，延长了外源性HA在关节内的留滞时间，减少了1个疗程所需要的注射次数，为治疗OA的长效制剂［12］。已有多种交联HA产品用于OA治疗。对瑞典Q-Med生产的交联HA水凝胶Durolane的研究发现，大鼠膝关节单次关节内注射Duro-lane56d后仍具有镇痛作用［13］。Durolane在关节腔的半衰期可长达4周，单次注射即可达到HA注射液3～5次注射的疗效［14］。Krocker等［15］对50名OA患者单次注射Durolane，以视觉模拟法(VAS)和欧洲生活质量评分(EQ-5D)等指标对患病膝关节功能、疼痛度、生活质量几个方面进行评测。结果表明:注射2周后，关节功能及生活质量明显好转，在随后的22周内，所有受试者各项参数，包括生活质量、膝关节活动度、疼痛评分等明显改善。HylanG-F20是一种已在多个国家上市的交联HA产品。Chevalier等［16］报道一项安慰剂对照临床试验中，253例初期膝OA患者单次关节腔内注射HylanG-F206mL后，患者疼痛得到有效缓解，效果维持至给药后26周，且安全性与安慰剂相近。多项临床研究结果表明，HylanG-F20对疼痛的缓解作用与皮质激素类相近，虽起效较慢但作用时间大大延长，且其不良反应发生率显著低于皮质激素类。长期服用非甾体抗炎药(NSAID)的膝和髋OA患者经HylanG-F20治疗后，NSAID的服用量大幅降低［17］。
但目前各种评价关节内注射HA(包括交联HA)治疗OA的有效性的临床研究结果仍存在着矛盾性［18-20］。这种差异可能与研究方案的设计、临床终点的设置、评价方法、意向-治疗分析的缺失、患者人群和所使用的药物有关。需采用患者数量更多、随访时间更长的随机对照试验来进一步客观、全面地评价黏度补充疗法对OA的作用，确定最能够从该疗法中获益的患者人群［21］。
2HA在软骨和骨组织工程中的应用
2.1在软骨组织工程中的应用组织工程是一种治疗关节软骨损伤的新兴技术，该项技术在软骨组织的修复中已取得了良好的早期结果。种植特定细胞源和生物活性分子的支架是该技术的关键［22］。HA作为一种生物材料，具有生物相容性、无毒性、非免疫原性和非致炎性，这些性质使其适合用作软骨组织工程的细胞载体［23-24］。天然HA水溶性极强，且缺乏支架所必需的力学性能，现有的研究多采用HA(及其衍生物)与其他材料制备复合组织工程支架。近年来，以HA为基础的软骨组织工程支架的研究取得了长足进展。
目前软骨组织工程支架的种子细胞多采用软骨细胞。软骨细胞在单层培养系统中容易失去其表型特征，而在三维构造中会维持其原始特征［25］。将HA加入接种了关节软骨细胞的胶原支架中，能够改善三维环境，改善软骨细胞的生长、功能和基质的沉积［26］。将人关节软骨细胞在HA的苄基衍生物HYAFF-11上培养3周，与培养在塑料上的软骨细胞相比，Ⅱ型胶原、转录因子Sox9和聚蛋白多糖显著增多，Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶(MMP)的表达下降［27］。来源于牛［28］、兔［29］、大鼠［30］和猪［31］软骨的软骨细胞包封在以HA为基础制备的支架后，发生软骨细胞再分化，蛋白聚糖合成增强，Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的表达提高。以上研究表明了HA在促进软骨基质合成、维持软骨细胞表型方面的有效性。
水凝胶能够更好地模拟细胞外基质的水合环境，因而成为软骨组织工程支架的一种重要形式，近年来发展的基于HA的支架大多采用这种形式。Pereira等［32］开发了一种新型可注射角叉菜胶/纤维蛋白/HA复合水凝胶。体外细胞培养研究显示，种植的人关节软骨细胞能够增殖并形成软骨特定细胞外基质。将种植了人软骨细胞的可注射水凝胶填充于实验形成的牛软骨块缺损，形成器官复合体。裸鼠皮下植入该器官复合体6周后，观察到牛关节软骨的再生。Tan等［33］通过琥珀酰-壳聚糖和醛化HA的原位交联获得了一种注射型复合水凝胶。包封于其中的牛软骨细胞24h后仍保持高活力和正常形态。Jin等［34］模拟软骨细胞胞外基质中蛋白聚糖的结构，合成了一种酪胺偶合葡聚糖-HA多糖杂化物，经酶催化交联后形成一种仿生水凝胶。研究显示，这种仿生水凝胶具有良好的生物相容性，并可为软骨细胞的增殖、分化及基质沉积提供支持性的微环境，适合用作注射型软骨组织工程支架。总之，以上研究显示基于HA的支架适合用作软骨再生中软骨细胞的传递工具。
骨髓多能间充质干细胞(bonemarrowmultipotentmesenchymalstemcell，BMMSC)是软骨组织工程的另一种常用的种子细胞。与软骨细胞相比，MSC体外易扩增，并且不会丢失分化能力。近年来，已采用多种生物材料来构建三维支架，形成适宜的微环境，控制干细胞的行为和分化，促进和诱导软骨组织形成。这其中包括相当数量的以HA及其衍生物为基础的支架。MSC的增生和分化中表达HA受体CD44［35］，以HA为基础的支架可能通过与CD44的相互作用影响干细胞的分化。Chung等［36］采用甲基丙烯酸酯化HA水凝胶对MSC在HA微环境中的软骨形成情况进行了研究，并与相对惰性的聚乙二醇水凝胶进行了对比。结果显示，HA水凝胶中Ⅱ型胶原的表达为聚乙二醇水凝胶中的43倍，提示HA对MSC的软骨定向分化有显著促进作用。
Pasquinelli等［37］检查了HA苄基衍生物(HYAFF-11)对种植的大鼠MSC的活力及增生的影响，实验中未进行化学诱导。种植24h后，约96%的细胞黏附于HYAFF-11表面，覆盖了整个支架表面的约12%。其后，细胞对支架的黏附稳步提高，21d后覆盖了支架表面的约40%。培养3d后即观察到MSC迁移至支架内部，7d后MSC即均匀地分布于支架内。培养21d后，发现细胞外周出现少量胶原纤维和粒丝状蛋白聚糖及丝状基质结构。种植于HYAFF-11的MSC的高活力、高黏附率及两者之间的良性相互作用说明该支架具有应用于软骨修复的潜能。一种将HA的生物学特征和丝素蛋白的优良机械性质相结合的HA-丝素蛋白复合支架与简单的丝素蛋白支架相比，能够使得BMMSC进行更有效的分化和组织形成［38］。将BMMSC种植于HA/明胶复合支架，然后植入家兔模型的内侧半月板缺损，12周后经检查发现BMMSC发生软骨分化，且植入的支架与宿主组织相结合［39］。
2.2在骨组织工程中的应用
近年来的研究表明，以HA为基础的支架(多采用水凝胶形式)适合用作种子细胞和诱导骨形成的活性分子的载体，应用于骨组织工程。Kim等［40］制备了一系列以HA丙烯酸酯为基础的水凝胶。将以硫代聚乙二醇为交联剂制备的水凝胶与骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)-2和MSC共同孵育，得到复合支架。该支架植入颅骨损伤部位后，能够促进骨钙素表达和成熟骨及血管的形成，提示这种水凝胶适合用作组织工程中的细胞和生长因子的载体。又将HA丙烯酸酯与对MMP敏感的肽(GCRDGPQGI-WGQDRCG)相连接，制得对MMP敏感的水凝胶。这种水凝胶与BMP-2形成的复合支架能够促进颅盖骨缺损的重建和再生［41］。Antunes等［42］在聚乳酸三维多孔支架表面覆盖戊二醛交联的HA来增加支架表面的粗糙程度，交联HA的引入未增加支架的细胞毒性，两者形成的复合支架更有利于骨组织工程应用。Chen等［43］对一种热可逆性可注射聚合物水凝胶(HA-CPN)在骨组织工程中的应用进行了研究。这种水凝胶是通过将HA和末端为羧基的聚异丙基丙烯酰胺接枝于壳聚糖骨架获得。将犬MSC种植于该凝胶，形成细胞-支架复合物(MSC/HA-CPN)。体外对MSC/HA-CPN进行7d的成骨诱导，其碱性磷酸酶活性和钙含量明显提高，提示该支架适用于骨形成和骨组织再生，是一种理想的三维细胞载体。
3以HA为基础的凝胶用在BMP的载体中的应用
BMP具有诱导成骨的作用，可以用来促进骨折愈合、修复骨缺损等，其中以重组人BMP-2在骨科应用最为广泛。BMP植入体内后，很快被扩散稀释或酶解吸收，难以在新骨形成的全过程中充分发挥其诱导成骨作用，因此需要有合适的载体，在成骨过程中发挥支架作用的同时使BMP得到缓慢释放［44］。研究表明，以HA为基础的凝胶适合用作BMP-2的载体，实现BMP-2的控制释放，在体内获得持续的诱导骨形成作用。
Bergman等［45］采用双筒注射器将HA醛衍生物及聚乙烯醇酰肼衍生物与BMP-2的混合液注射入大鼠股四头肌，通过原位交联形成水凝胶。4周后观察到凝胶植入部位有异位骨形成，其体积与植入的凝胶体积相当，骨矿物质密度接近于股骨。研究结果表明，这种可注射水凝胶可采取最小侵袭性方法，作为运送BMP-2的无细胞支架，应用于骨组织形成。Martínez-Sanz等［46］制备了HA的醛衍生物和酰肼衍生物，交联后获得无细胞毒性的凝胶。体外试验显示，这种水凝胶能实现活性BMP-2的控制释放。将携带BMP-2的水凝胶注射入大鼠颅盖，8周后观察到骨组织形成。组织学检查显示，新形成的骨高表达骨钙素和骨桥蛋白，提示该凝胶可作为BMP-2的载体，促进骨量扩增。
4HA在制备骨组织替代物中的应用
由于机械强度较弱，HA单一成分不适合作为骨组织的替代物，往往需要与其他成分混合制备骨替代物。Pek等［47］采用纳米晶体羟基磷灰石和交联的HA-酪胺轭合物制备了一种骨水泥，与传统骨水泥相比具有极低的热释放量，能够避免对周围组织的损伤，并成功修复了小鼠小型骨及关节缺损。
5HA在椎间盘再生(intervertebraldisc，IVD)中的应用
潜能IVD是一种无血管、无神经结构，由外部纤维环、内部胶状髓核和邻近的软骨终板构成。与软骨组织类似，IVD损伤的自愈能力较弱。IVD的退行性改变能够进一步影响其他脊柱结构，并最终导致大范围的结构异常和正常运动节段功能的损失［48］。
近年来组织工程技术在IVD受损组织再生中的应用得到迅速发展，HA是构建组织工程支架的常用天然生物材料之一。Halloran等［49］制备了非交联和酶交联胶原-HA复合支架。将牛髓核细胞种植于支架中，并培养7d，观察到交联复合支架未对细胞活力和增生产生任何负面影响。与非交联支架相比，种植于交联支架中的细胞其蛋白聚糖合成率较高，硫酸化糖胺聚糖的流失较少。Nesti等［50］将人BMMSC种植于包封HA水凝胶的生物可降解纳米纤维复合支架中。这种复合支架的外层为聚乳酸纳米纤维，内层注入HA水凝胶以提供支撑结构，并提高复合支架在细胞增生、分化中的生物相容性。体外培养28d，加入转化生长因子β诱导软骨形成。在体外培养中，种植细胞逐渐发育为软骨细胞表型，这些细胞保持了天然IVD的微结构。形成的软骨样HA纳米纤维支架复合体的结构与天然的IVD相似，都具有外部纤维环样结构和内部髓核样结构。总之，这种MSC/HA的IVD复合体具有应用于退化IVD的组织工程修复的潜能。Revell等［51］检查了2种HA衍生的生物可降解聚合物，HYAFF-120和HYADD-3在猪髓核切除术模型中对受损IVD的修复作用。研究中将自体BMMSC种植于HA凝胶中，然后注入切除髓核后的IVD中。与仅实施髓核切除术的对照组相比，种植或不种植MSC的植入HA凝胶都维持了髓核的正常两面凸起结构，6周后都含有形成基质的活软骨细胞。Cal-deron等［52］研制了一种交联Ⅱ型胶原-HA复合水凝胶，作为MSC的载体，应用于髓核的再生。这种水凝胶具有良好的稳定性和机械强度，种植的MSC细胞活力高，生长情况良好，并分化为软骨细胞。近年来的研究成果表明，HA可构建工程化IVD，用于IVD的修复和再生。
6HA寡糖对骨肉瘤的抑制作用
骨肉瘤是一种较常见的恶性骨肿瘤，易发于青少年，死亡率高。Hosono等［53］研究发现，外源性HA寡糖对LM-8和MG-63骨肉瘤细胞有显著的抑制作用。细胞活力分析和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP原位切口末端标记的分析结果分别表明，HA八糖可以显著抑制肿瘤细胞活力，并可诱导其凋亡。八糖还可以削弱细胞基质的功能，并显著降低内源性HA的存留量。另外，八糖能够抑制肿瘤细胞的迁移和入侵。肺是骨肉瘤转移的主要靶器官，应用化疗前，80%～90%的患者死于肺转移［54］。在体肿瘤内注射HA八糖可降低内源性HA在肿瘤部位的聚集，从而显著抑制了肺癌远端转移灶的形成。Nishida等［55］在2010年第8届Hyaluronan国际大会上再次公开了以上研究结果。以上研究表明，HA寡糖具有开发为抗恶性骨肿瘤药物的潜能。
