关键词：A蛋白；耐碱性；动态载量
全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单抗药物主要是由中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycell，简称CHO细胞）表达产生，由CHO细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/L，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。
根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯（样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的50%-80%。用A蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达95%以上。但A蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，A蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的35%以上。因此，蛋白A纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。
1A蛋白的性质金黄色葡萄球菌
A蛋白（StaphylococalProteinA，SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区域结合。天然的A蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm%=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的SPA54KD，去掉与细胞壁结合部分的SPA42KD。SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。近几年来基因工程的SPA出现，解决了天然A蛋白的耐碱性问题，MabSelectSure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的DACE区域，对于B区域进行了修饰，将不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修饰后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；这就很好的解决了层析介质CIP的问题，同时修饰后的SPA也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对SPA的作用，使洗脱收集液中SPA的脱落更低。
2结合单抗的A蛋白层析介质的选择
在A蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是HCP和基因组DNA；由于A蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱pH，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有A蛋白（配基）的脱落。在A蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基A蛋白，以及A蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是proteinA的脱落原因，所以选择A蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。
2.1A蛋白层析介质相关指标
耐碱性：药物GMP生产最基本的要求是无菌、无热源。NaOH是最好的除菌、出热源的试剂。同时NaOH也是公认的CIP试剂，使用NaOH可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；郧NaoH的成本低。NaOH是公认的CIP试剂，实验表明，NaOH的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。CPG填料在高pH下不稳定，不适合用NaOH清洗。传统的A蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，郧以谂渲檬迸ǘ冉细撸这对生产是一个瓶颈。
GE公司的MabSelectSure系列是通过基因工程修饰的A蛋白介质，去除了不耐受NaOH的氨基酸，提高了层析介质耐受NaOH的能力。同时MabSelectSureLX是最新的A蛋白层析介质，结合了耐碱和高载量的性质。另外，MabselectSure和MabselectSureLX介质在NaoH清洗后寿命可以在300次以上。使用不同浓度的NaOH清洗MabselectSure的使用次数。随着抗体技术的发展，培养条件改善以及表达量的大幅度提高（生产规模已经到达3-5g/L），杂质的量（HCP）也随之提高[3]。如果不能将介质清洗干净，这会影响工艺以及产品的质量。在这种情况下使用高浓度的NaOH（0.5M）的非常必要的。
载量及保留时间：一般ProteinA层析介质的理论载量为80g/L左右。高载量可以减少层析柱的体积。保留时间是指样品在层析柱内的停留时间或样品与层析介质的接触时间。较低的保留时间可以使用较快的流速，从而提高生产效率。
在抗体纯化工艺开发时，对于动态载量以及保留时间是一个平衡的过程，单纯追求高动态载量，可能保留时间会较长，使得上样时间延长，这样培养基中的蛋白酶就有时间分解样品，以及上样时蛋白酶降解A蛋白，使A蛋白的脱落增加。另外一些高载量的A蛋白层析介质，是通过提高配基密度增加动态载量的。但是配基密度提高过程中，如果配基与的层析基质（骨架）的偶联不稳定，就会增加A蛋白的脱落。此类A蛋白介质在初期动态载量较高，经过一段时间的使用，随着配基的脱落，载量很快降低。
单纯追求高流速，可能会使层析介质的柱压升高，提高了纯化过程中对生产设备（层析柱以及层析系统）的要求，从而增加层析柱以及层析系统的采购成本。随着上样次数的增多（生产循环次数的增加）层析介质的反压增加，从而减少层析介质的寿命。另外，有文献报道，以硅胶基质或CPG的在重复装柱的过程中易破碎，从而增加运行的压力以及影响介质的寿命。现代的A蛋白的动态载量一般在35-60g/L之间，保留时间一般在3-5min左右（20cm柱床高度，线性流速在250-400cm/h）。
配基脱落率：配基脱落在单抗药物中有严格的规定，在最终的药物中proteinA的残留
非特异杂质吸附低：A蛋白捕获的样品是细胞培养的上清液。宿主蛋白是捕获步骤的主要杂质。虽然ProteinA对抗体的Fc有特异性、专一性，但是层析介质的基质（骨架）有时会对杂质有非特异吸附。有文献报道以聚合物为基质的ProteinA层析介质非特异吸附较高，洗脱时宿主蛋白会与抗体共同洗脱。从而HCP的残留量较高。
层析介质压力/流速特性：在生产中层析介质的装柱是必不可少的一项工作。这与小规模实验室层析柱的使用是完全不同的。生产中使用的层析柱一般直径在300mm以上；有些剂量大的项目，生产中需要使用直径1-1.4m的层析柱。其装柱不只是层析柱的设计，层析介质的装柱方法是否适用，以及在装柱过程中层析介质是否易破碎时关键的因素。
商业规模的层析介质主要分为两种：层析介质的压力/流速曲线在放大过程中在层析介质的拆装过程中对于较硬的CPG骨架的介质容易破碎，从而进一步增加使用中的压力。以琼脂糖为骨架的层析介质，有一定的弹性。加之可以很好的清洗，所以在生产中可以保持很好的压力/流速曲线。
综上，在单克隆抗体的纯化工艺中ProteinA的捕获步骤是十分重要的，选择耐碱性好、适宜载量、配基脱落率低等性质的层析介质，可以延长其使用寿命，并减少生产成本和风险。
参考文献
[1]ScottAM，WolchokJD，OldLJ.Antibodytherapyofcancer.NatRevCancer，2012，12（4）：278-287.
关键词：蛋白质结晶；影响因素；结晶技术
一、前言
现今对蛋白质三维结构测定的主要手段有X射线晶体衍射技术（XRD）、核磁共振技术（NMR）和低温冷冻电镜技术（Cryo-EM）。[1]其中，X射线晶体衍射技术是获得蛋白质三维结构最普遍，最可靠的手段。而获得适合X射线晶体衍射的蛋白质晶体则是这一技术的基本要求和重要步骤。
二、蛋白质结晶化原理
蛋白质结晶化即是蛋白质在溶液中的相变过程，分为两个主要步骤：一是蛋白质晶核的形成；二是蛋白质晶核的生长。晶核的形成是结晶化的基础和核心，一般情况下，在蛋白质过饱和溶液中，大量的过饱和蛋白质容易形成稳定的非晶态沉淀或微晶，并在过饱和度的推动下使蛋白质分子有序排列，形成晶核。晶核形成后，溶液中蛋白质分子减少、饱和度下降从而处于亚稳态，溶液中的蛋白质分子有序的沿着晶核继续排列生长，当晶体长大到一定程度后，析出溶液，最终停止生长，结晶过程结束。
三、蛋白质结晶化影响因素
3.1温度的影响
温度对蛋白质结晶的影响体现在蛋白质溶液的热历史效应和蛋白质结晶的过程影响两个方面。蛋白质溶液的热历史效应是指在保存蛋白质溶液时的保存温度。实验证明[2]蛋白质的热历史效应会影响蛋白质的结晶数目和结晶尺寸。对蛋白质溶液进行热处理可以减小晶体数量同时增加晶体尺寸。温度对蛋白质结晶过程的影响在于不同的蛋白质所需要的结晶温度不同，一般来说，大部分结晶在4～22℃下进行。
3.2PH值的影响
PH值对蛋白质的影响体现在改变其带电性质和溶解度方面。研究表明，当PH值接近蛋白质等电点时，蛋白质所带电荷接近为0，蛋白质溶解度最低。一般来说，PH值接近蛋白质的等电点，有利于蛋白质晶体的析出。[3]当溶液PH值靠近最佳PH值时，则会形成单一晶型的高质量蛋白质晶体。
3.3过饱和度的影响
蛋白质晶核形成的主要推动力为过饱和蛋白质溶液的过饱和度。由于由高过饱和度驱动蛋白质结晶会发生结晶缺陷和杂质引入，所以应先引入低过饱和度以延迟诱导，然后慢慢增加过饱和度最后达到临界过饱和度。大量实验表明[4]，最佳溶液的过饱和度为略微高于蛋白质溶液亚稳态区的上界，此时，在形成晶核后由于蛋白质浓度降低而直接进入亚稳态。
3.4强迫流动环境的影响
低流速的强迫流动环境可以补充晶体周围的蛋白质空缺，使晶体界面处晶体的生长速度和蛋白质浓度达到动态平衡。实验表明，[5]低流速的强迫流动环境可以形成大而好的蛋白质晶体，而高流速的强迫流动环境则会对晶体造成缺陷，因此具有一个最佳流速，可以加快结晶形成又不会破坏晶体结构。
四、蛋白质结晶相关技术
4.1常规结晶技术
常规的蛋白质结晶方法有：批量结晶法、蒸汽扩散法、液―液扩散法和透析结晶法四种。[6]
4.1.1批量结晶法
现在最普遍的批量结晶法为微池法，通过计算机调控的微分布器，来精确调控微池法中液滴的组分和沉淀剂的加入量，从而使蛋白质逐渐达到低过饱和，形成结晶。
4.1.2蒸汽扩散法
蒸汽扩散法是指将某种蛋白质结晶所需盐溶液与略低于该溶液浓度的蛋白质溶液同时放在密闭的体系内，使其蒸发扩散，最终达到平衡，最终形成结晶。
4.1.3液―液扩散法
该法指将蛋白质溶液和沉淀剂溶液分别放于毛细管两端，使其自由扩散达到平衡，晶体将在最佳浓度梯度出生长。
4.1.4透析结晶法
透析结晶法是将蛋白质溶液放入透析袋中，袋外为高浓度盐溶液，通过透析调节蛋白质溶液浓度，最终达到低过饱和度，形成晶体。
4.2膜结晶技术
膜结晶技术是将膜蒸馏技术和结晶技术相耦合而产生的一种新型结晶分离技术。其原理为通过膜蒸馏技术蒸馏出溶液中的溶剂，浓缩溶质使其达到过饱和，从而形成晶核最终使溶质结晶出来。与常规结晶技术相比，膜结晶技术的优点在于结晶速度快，诱导时间短，起始浓度低，过程可操控等。[7]因此作为一种新型的结晶技术，膜结晶技术以其独特的优势迅速发展，在蛋白质等生物大分子的结晶领域有着广阔的发展前景。国内外众多实验室均通过该技术获得了质量更高的理想晶型。
4.3微流控芯片技术
随着近年来微流体的迅速发展，微流控技术应用与蛋白质结晶条件的高通量筛选取得了显著的成果。常规的蛋白质结晶技术不可能针对所有的结晶条件都进行尝试，而且耗费大量时间、人力。而基于微流控芯片技术的高通量蛋白质结晶，则可以同时进行成百上千个蛋白质结晶实验，大大提高了结晶条件筛选效率，对加速蛋白质工程的研究进展有着重要意义。同时，微流体系统在微观尺度下具有一些宏观状态所不具备的性质，对蛋白质结晶十分有利。目前的蛋白质微流控结晶技术有如下几种[8]：微流控自由界面扩散结晶技术、微流控油下结晶技术、微流控蒸发扩散结晶技术、微流控透析结晶技术。
五、结束语
蛋白质结晶的过程十分复杂，受到多种因素的影响，通过对各种影响因素的研究，人为的调整控制蛋白质结晶过程中的条件达到最佳，对于获得高质量的蛋白质结晶有着重要的意义。近年来对于蛋白质结晶的研究不断深入，各种新型结晶技术不断出现，解决了以往的技术难题，其中膜结晶和微流控高通量结晶技术的出现更是极大地促进了蛋白质工程的快速发展。
参考文献
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[5]鹿芹芹，尹大川，刘永明，等.提高蛋白质晶体质量的研究进展[J].材料导报，2010，1：025.
关键词：麦麸；膳食纤维；酶解法；蛋白质残留率
中图分类号：TS210.9文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）23-6215-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.054
Abstract：Usingwheatbranasrawmaterial，removingdietaryfiberfromwheatbranproteinbyenzymaticdecompositionmethodwasstudied.Thetechnologywereoptimizedbyorthogonaltestonthebasisofsinglefactorexperiment.Resultsshowedthattheoptimumconditionswerethedosageofalkalineprotease0.4%，hydrolysistemperature60℃，hydrolysistime90minandhydrolysispH8.5.Undertheseconditions，theproteinresidueratiowas3.54%.Themainfactorthatinfluencedproteinresiduesmostwasthedosageofalkalineprotease.
Keywords：wheatbran；dietaryfiber；enzymedecompositionmethod；proteinresidueratio
麦麸是小麦制粉加工过程中的主要副产品，其比例约占小麦制粉加工量的20%。小麦麸皮主要由小麦的皮层组织、胚乳和麦胚组成，除大量的纤维成分外，还含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素等营养成分，因此，麦麸被视为重要的膳食纤维资源[1，2]。膳食纤维是一种多糖，它既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量，具有较强的吸水能力，可促进肠道蠕动而防止便秘，可抑制胆固醇的吸收而预防动脉硬化，可抑制葡萄糖的吸收而降低血糖浓度，还可以吸附肠道的钠离子而降低血压。此外，膳食纤维因不能被人体消化吸收，易使人产生饱腹感，还可作为肥胖患者减肥的疗效食品。膳食纤维现已成为关注的焦点，并被营养学界补充认定为第七类营养素[3-7]。
膳食w维的制备方法有物理法、化学法、酶-化结合法、酶法，其中酶法是一种更为常用的方法。酶法是指利用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶分别除去淀粉和蛋白质，得到纯度更高的膳食纤维[5]。本研究以麦麸为原料，采用酶法去除麦麸中的蛋白质，采用单因素和正交试验对酶解工艺进行了探讨，为探寻酶法制备麦麸膳食纤维提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
麦麸由湖北省同光面粉厂提供；碱性蛋白酶（200U/mg）、胰蛋白酶（250U/mg）、木瓜蛋白酶（800U/mg）均购于上海源叶生物科技有限公司；中性蛋白酶（60000U/g）购于武汉市华顺生物技术有限公司；乙醇、二甲亚砜、盐酸等均为分析纯。
UV-280型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；TYSP-200型高速多功能粉碎机，浙江省永康市红太阳机电有限公司；HJ-4A型磁力搅拌器，江苏金坛市宏华仪器厂；LXJ-IIB型离心机，上海安亭科学仪器厂；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SHA-B恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。
1.2方法
1.2.1麦麸膳食纤维制备工艺流程麦麸膳食纤维制备工艺：称取一定量麦麸，加入适量蒸馏水，95℃糊化15min后冷却至室温；调节溶液pH，去除淀粉，水浴振荡，煮沸灭酶；调节pH，去除蛋白质，煮沸灭酶，冷却离心，取上清液，浓缩、醇沉、离心，得到沉淀，合并之前滤渣干燥即为麦麸膳食纤维。
1.2.2麦麸基本成分分析对麦麸中水分、蛋白质、脂肪、灰分、淀粉、膳食纤维等基本成分进行分析。
1.2.3单因素试验以酶解后，麦麸中蛋白质的残留率为指标，采用单因素试验对麦麸膳食纤维制备工艺中蛋白酶种类（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶）、料液比（1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20）（麦麸∶去离子水=g∶mL）、蛋白酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%）、酶解时间（30、50、70、90、110、130min）、酶解pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶解温度（40、45、50、55、60、65℃）进行分析。
在进行单因素试验过程中，探讨某一单因素时，其他各因素水平分别定为碱性蛋白酶、料液比1∶14、蛋白酶添加量0.5%、酶解时间90min、酶解pH8.5、酶解温度55℃。
1.2.4正交试验在单因素试验基础上，进行四因素三水平正交试验，进一步探讨酶解法去除麦麸膳食纤维中蛋白质的最优工艺，正交试验因素和水平如表1所示。
1.3测定方法
水分、蛋白质、脂肪、灰分、淀粉、膳食纤维分别参照GB/T5009.3-2010、GB/T5009.5-2010、GB/T14772-2008、GB/T5009.9-2008、GB/T5009.88-2008等方法进行测定。
2结果与分析
2.1麦麸基本成分分析
麦麸基本成分中膳食纤维、淀粉和蛋白质含量较高，分别为45.12%、17.92%、16.10%，水分、脂肪、灰分含量分别为8.18%、3.47%、4.68%，其中蛋白质含量高是影响麦麸膳食纤维制备的主要因素，因此，有效去除麦麸中蛋白质是制备麦麸膳食纤维的关键。
2.2酶解制备麦麸膳食纤维单因素试验结果
2.2.1蛋白酶种类对麦麸中蛋白质残留率的影响不同种类蛋白酶对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图1所示。从图1中可以看出，经碱性蛋白酶水解后的麦麸残渣中的蛋白质残留率为6.15%，比原有麦麸中的蛋白质含量降低了9.95个百分点，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶水解效率相差不大，复合蛋白酶的水解效率最低，蛋白质残留率为11.33%，比原有麦麸中的蛋白质含量相比仅降低了4.77个百分点，因此，选用碱性蛋白酶水解麦麸蛋白质。
2.2.2料液比对麦麸中蛋白质残留率的影响不同料液比对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图2所示。从图2中可以看出，麦麸中蛋白质残留率随料液比的增加呈先降低后上升的趋势。当料液比为1∶14时，蛋白质残留率最低，为7.66%，与原有麦麸中的蛋白质含量相比，降低了8.44个百分点，而当料液比大于1∶14时，蛋白质残留率反而升高了，料液比为1∶20时，蛋白质残留率为9.80%，与原有麦麸中蛋白质含量相比，仅降低了6.30个百分点。这主要是因为随着料液比的增加，底物与酶浓度被稀释了，从而使蛋白酶的活性降低，影响了蛋白质的残留率。
2.2.3蛋白酶添加量对麦麸中蛋白质残留率的影响不同蛋白酶添加量对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图3所示。从图3中可以看出，随着蛋白酶添加量的增加，麦麸中蛋白质的残留率呈先下降后上升的变化趋势。当蛋白酶的添加量为0.5%时，麦麸中蛋白质残留率最低为7.95%，与原麦麸的蛋白质含量相比，降到了8.15个百分点；当酶的添加量为1.0%时，蛋白质残留率最高为11.53%，与原麦麸相比，仅下降了4.57个百分点。这可能是因为蛋白酶本身也是一种蛋白质，当添加量较高时，也会造成麦麸中的蛋白质残留率升高。
2.2.4酶解时间对麦麸中蛋白质残留率的影响不同蛋白酶添加量对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图4所示。从图4中可以看出，随着酶解时间的延长，麦麸中蛋白质的残留率呈下降的变化趋势。碱性蛋白酶与麦麸蛋白作用30～50min内，蛋白残留率由15.02%急剧下降到9.92%；50～110min，随着酶解时间的延长，蛋白质的残留率变化较小；110min时，麦麸中的蛋白质残留率最低为8.27%，与原麦麸中蛋白质含量相比，蛋白含量下降了7.83个百分点，当反应110min后，蛋白质残留率变化不明显，可能是因为麦麸中的蛋白质基本被分解完全。
2.2.5pH对麦麸中蛋白质残留率的影响不同pH对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图5所示。从图5中可以看出，随着酶解pH的增大，麦麸中蛋白质的残留率呈先下降后上升的变化趋势。当溶液pH为8.5时，蛋白质残留率最低为7.63%；当溶液pH从8.5增加到10.0后，蛋白质的残留率从7.63%上升到13.75%；当溶液pH为10.5时，蛋白质残留率变为13.64%，略有降低。这主要是因为过高的pH会抑制蛋白酶的活性，而当溶液pH升到10.5时，麸皮中的蛋白质溶解在碱性溶液中，导致麦麸中的蛋白质残留率有所下降。
2.2.6温度对麦麸中蛋白质残留率的影响不同温度对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响结果如图6所示。从图6中可以看出，随着酶解温度的增大，麦麸中蛋白质的残留率呈先下降后上升的变化趋势。当酶解温度为40～45℃时，麦麸中的蛋白质残留率下降不明显。当温度达到50℃时，麦麸中的蛋白质残留率下降较明显，当温度为55℃时，蛋白残留率最低为9.06%，说明碱性蛋白酶水解麦麸蛋白质的最适温度为50～60℃，当温度升高到65℃时，蛋白质残留率又开始上升，这可能有两方面原因，一是温度较高，抑制了蛋白酶的活性，阻碍了麦麸蛋白质的水解；二是温度较高，蛋白质变性，也可能形成凝胶，阻碍了麦麸蛋白质的水解。
2.3正交试验
根据单因素试验结果，以麦麸膳食纤维中蛋白质残留率为指标，对酶解去除蛋白质工艺进行四因素三水平正交试验，试验结果如表2所示。
从表2中各因素极差可以看出，4个因素对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率影响大小顺序为蛋白酶添加量>酶解温度>酶解pH>酶解时间，各因素最优水平组合为A2B3C2D2，即为蛋白酶添加量0.4%、酶解温度60℃、酶解时间90min、酶解pH8.5。正交试验9个处理中，最优因素水平组合为A2B3C1D2，即为蛋白酶添加量0.4%、酶解温度60℃、酶解时间70min、酶解pH8.5，此时所得麦麸膳食纤维中蛋白残留率仅为4.93%。根据验证试验，当分别按照A2B3C1D2和A2B3C2D2酶解麦麸蛋白质时，验证试验结果分别为4.39%和3.54%。因此，碱性蛋白酶酶解麦麸蛋白质的最优组合为A2B3C2D2，即添加蛋白酶量为0.4%，酶解温度为60℃，酶解时间90min，酶解pH8.5。
3小结与讨论
在前人的研究中，田学森等[8]确定了酶法制备麦麸膳食纤维的最优工艺参数，混合酶的用量为0.2%，淀粉酶与糖化酶的比为1∶3，酶解时间30min，混合酶解温度60℃。缪岳琴等[9]选出最佳蛋白水解酶为木瓜蛋白酶，通过正交试验确定了α-淀粉酶和糖化酶的最佳水解条件。冯志强等[10]研究得到的最佳工艺组合为混合酶制剂用量0.3%，α-淀粉酶与糖化酶用量的比值1∶1，混合酶的酶解时间30min，蛋白酶制剂用量0.5%，蛋白酶酶解时间30min。李慧静等[11]经研究发现，响应面法优化麦麸膳食纤维提取工艺参数为蛋白酶用量0.4%，蛋白酶反应时间60min，α-淀粉酶与糖化酶比值1∶3，用量0.5%，酶反应时间30min。
本试验先后采用单因素试验和正交试验对酶解去除麦麸中蛋白质的工艺进行了探讨，结果表明碱性蛋白酶添加量为0.4%，酶解温度为60℃，酶解时间90min，酶解pH8.5，此工艺下所制备的麦麸膳食纤维蛋白质残留率仅为3.54%。从正交试验各因素对麦麸膳食纤维中蛋白质残留率的影响大小来看，碱性蛋白酶添加量的影响最大。
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