目的探讨髓系细胞触发受体1(TREM1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况。方法先后用PMA、oxLDL诱导人U937细胞，使其转化为泡沫细胞。用RTPCR法及Western印迹法检测PMA诱导组、低密度脂蛋白（LDL）组和oxLDL组细胞中TREM1mRNA及蛋白的表达。结果与PMA诱导组、PMA+LDL组细胞比较，PMA+oxLDL组细胞TREM1mRNA及蛋白表达水平均明显增高（P
【关键词】泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化
泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。U937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度脂蛋白胆固醇（oxLDL）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells1，TREM1）是一个30ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素8（IL8）和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的生成。因此，TREM1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关TREM1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用PMA及oxLDL诱导U937细胞向泡沫细胞转化，用RTPCR及Western印迹法探讨TREM1在此过程中的表达情况。
1材料与方法
1.1细胞来源及主要试剂
U937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48h，在含10%小牛血清RPMI1640培养基中呈悬浮样生长。
oxLDL由Yuanyuanbiotechnology提供。佛波酯购自Sigma公司。RPMI1640培养基和Trizol购自Gibco公司。MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTP、Oligo（dT）购自Fermentas公司。小鼠抗人TREM1单克隆体为Abnova公司产品，兔抗人GAPDH抗体为SantaCruz产品。ECL发光试剂盒为Millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2U937细胞的分化及诱导
呈对数生长的U937细胞（细胞密度1.0×109/L），加入终浓为100nmol/LPMA，孵育72h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样U937细胞。用无血清培养液培养12h后，换成含oxLDL(终浓度为100mg/L)的培养液继续培养24h，将上述巨噬细胞样U937细胞诱导为泡沫细胞。
1.3油红O染色法鉴定U937泡沫细胞
将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红O染色20min，苏木素染色5min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。
1.4实验分组
将经PMA诱导的U937细胞平均分为3组，分别为PMA诱导组，PMA+低密度脂蛋白（LDL）组和PMA+oxLDL组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的RPMI1640培养液、含LDL终浓度为100mg/L的培养液及含oxLDL终浓度为100mg/L的培养液培养24h，收集培养细胞进行RTPCR检测及Western印迹检测。
1.5RTPCR法检测培养细胞中TREM1mRNA的表达
按Trizol说明书提取培养细胞总RNA，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2μl用于PCR，反应条件为cDNA预变性94℃5min后，经94℃30s，55℃30s；72℃30s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10min。反应结束后取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以GAPDH密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。
根据GenBank提供数据设计引物。TREM1引物上游序列为5′TGCTGTGGATGCTCTTTGTC3′，下游序列为5′CACAGTTCTGGGGCTGGTAT3′，扩增片段长度为491bp；GAPDH引物上游序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游序列为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度为452bp。以上引物均由上海捷瑞公司合成，用TE缓冲液稀释成终浓度为15pmol/L，-20℃贮存备用。
1.6Western印迹法检测培养细胞中TREM1蛋白的表达
将培养细胞用细胞裂解液收集并充分裂解后，进行10%SDSPAGE电泳，电转膜，丽春红染色，观察转膜效果；以PBST洗膜15min，共4次，室温下2%脱脂奶粉封闭1h；分别加适当稀释的一抗（TREM1按1∶500稀释，GAPDH按1∶2000稀释）4℃孵育过夜；PBST洗膜15min，共4次，加二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG）室温2h；PBTS充分洗膜，用ECL试剂盒化学发光检测，GAPDH为内对照，用图像分析仪分析各组条带光密度值。
2结果
2.1泡沫细胞的形态学鉴定
U937细胞经过PMA诱导72h后，倒置显微镜下观察，多数细胞由圆形变成多角形，并易于聚集、贴壁，表明细胞已由单核细胞分化后具有巨噬细胞样特征。经oxLDL油红染色后可见培养细胞明显显示出泡沫样改变，胞浆内较多的脂滴颗粒存在，且发现由于个别细胞吞噬了过多脂滴而致细胞体积增大（见图1），而未加oxLDL的对照组细胞及LDL对照组细胞内无明显脂滴颗粒。
2.2TREM1mRNA及TREM1蛋白在泡沫细胞中的表达
RTPCR结果显示，TREM1扩增产物为492bp。结合Western印迹结果显示，与PMA组及PMA+LDL组比较，PMA+oxLDL组TREM1mRNA及TREM1蛋白表达量明显增加（P
3讨论
AS是一个复杂的炎症免疫反应病理过程，AS斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、oxLDL负载的巨噬细胞（即泡沫细胞）和T淋巴细胞等炎性反应细胞浸润〔2〕。病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞，后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与oxLDL结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。同时，巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞时可生成血管内皮生长因子（VEGF）、TNFα等细胞因子，这些因子在AS的发生发展中起着关键作用〔3，4〕。近年来的研究发现，肺炎衣原体、幽门螺杆菌、巨细胞病毒等病原体通过激活炎症反应及损伤内皮而促进冠心病的发生发展〔5〕，提示AS与感染性疾病的发病机制可能密切相关。
TREM1属免疫球蛋白超家族成员，能显著放大由脂多糖（LPS）等细菌产物引发的急性炎症反应，在感染性休克发生中具有重要作用，因而引起越来越多研究者的关注。研究表明，TREM1不仅与细菌感染相关的急性炎症有关，在一些病毒感染性炎症、非特异性慢性炎症、缺血再灌注损伤、烧伤、甚至肿瘤的复发及预后判断方面都有重要作用〔6，7〕。
U937本质上是人单核细胞，经佛波酯、oxLDL刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。U937的这一特性使其成为体外研究泡沫细胞形成机制的重要工具。本研究用RTPCR法及Western印迹法对U937向泡沫细胞转化过程中TREM1mRNA及蛋白表达情况进行检测，结果发现单核细胞在向泡沫细胞转化过程中表达量不断增加，提示TREM1参与泡沫细胞的形成，可能与AS斑块的发生发展密切相关。因此TREM1可能成为AS治疗的一个新的靶点或监测AS进展的一项新指标。
参考文献
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关于肿瘤干细胞的起源，一种认为肿瘤干细胞起源于正常干细胞，干细胞不断积累了基因突变，最终转化为肿瘤干细胞。另一种认为肿瘤干细胞起源于重新获得干细胞特性的祖细胞或已分化的细胞，这些细胞在一次或多次基因事件中获得了自我更新和分化潜能，转化为肿瘤干细胞。临床上肿瘤干细胞对放疗及化疗药物不敏感，可能是肿瘤转移、复发的根源。
近年来越来越多的证据支持肿瘤干细胞的存在。1997年Bonnet在急性粒细胞白血病（AML）中分离出白血病肿瘤干细胞，其表面标记为CD34+/CD38-，只占急性粒细胞白血病细胞总数的0.2%，具有免疫缺陷鼠成瘤性。2003年AL-Hajj等在实体瘤乳腺癌中分离出具有CD44+/CD24-/Lin-/ESA+的一类细胞，把这类细胞移植到NOD/SCID小鼠乳腺的脂肪垫中，能够形成肿瘤，而且此肿瘤的表型与这类细胞来源的肿瘤的表形是一致的。随后，不断有从实体瘤中分离出肿瘤干细胞的报道。脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、结肠癌及胰腺癌中肿瘤干细胞相继被分离鉴定出来，强有力的支持了肿瘤干细胞学说。
上世纪末以来，靶向治疗是一热门话题，新靶向治疗药物不断涌现为肿瘤治疗提供了全新的理念和方法。靶向治疗的关键是筛选出治疗靶点。随着研究的深入，近年人们试图从对正常干细胞及肿瘤干细胞自我更新的信号传导通路的研究中，发现有效的肿瘤治疗靶点。
调控肿瘤生长、增殖的Wnt，Notch，Hedgehog，Bim-1信号传导通路均在肿瘤干细胞的自我更新发挥着重要的作用。一些转录因子OCT4,SOX2,NANOG被证实在胚胎干细胞的自我更新和胚胎的早期发育中发挥着重要的作用。研究证明各种信号通路，基因和转录因子构成了调控干细胞自我更新的微环境，在这种微环境中，各种因子相互作用，共同维持着干细胞的自身稳态。微小RNA(miRNAs)可能在各种因子的相互作用、相互调节中发挥着重要作用，其机制尚需进一步深入研究。
在对肿瘤癌干细胞信号传导通路的靶向治疗研究中，已经有新药在研发中或进入I期临床试验。如MERCK公司针对NOTCH通路的靶向药物GammaSecretaseInhibitor治疗乳腺癌，针对HEDGEHOG通路的药物有Infinity公司研发的Cyclopamine(smoothenedinhibiteos)，以及针对P53的MDM2Inhibitor（Ascenta公司）。2007年宋尔卫等在《cell》发表文章，报道在小鼠试验，发现“let-7”-miRNA干扰，可明显抑制乳腺肿瘤干细胞(BT-IC)，使其在体外和体内的自我增殖能力、多向分化和成瘤能力均显著下降。
1血管内皮细胞的形态学特征及生理功能
血管内皮细胞（VEC）是一层连续覆盖整个血管腔表面的扁平鳞状细胞。厚度约为0.1~1μm。VEC可伸出细胞质突起到管腔内，以扩大VEC的表面积。研究发现人的VEC总面积约为350~400m2，为血液和组织之间的物质交换提供了巨大的表面积[1]。血管内皮细胞不仅是循环血液与血管平滑肌细胞间的机械屏障，而且是人体最大、最重要的一种内分泌器官。由于他所具有的机械屏障作用，使它很容易受到体内外各种物理、化学因素的损伤；受损后的VEC功能尤其是内分泌功能必然失调，使其分泌的多种活性物质或与这些活性物质有关的其他物质之间的平衡被打破，从而导致心血管系统的功能障碍[2]。血管内皮细胞的生理功能包括：①调节血管壁通透性。VEC通过其表面结构如离子屏障、黏附连接结构及内皮细胞的收缩性来调节血管壁通透性，从而控制血液中的可溶性物质如电解质、小分子物质及各种血浆大分子和血细胞成分如白细胞、红细胞等进入内皮下组织，起着选择性通透屏障作用[3]；②维持出凝血功能平衡和血液流动状态。正常情况下，VEC表面光滑且带有负电荷，可以防止血细胞的聚集；其表层的硫酸肝素能有效抑制血小板聚集；它产生的一氧化氮（NO）和前列腺素的衍生物，特别是前列环素，不仅是强有力的扩血管物质，并且能有效抑制血小板的变形和聚集[3]；另外，VEC产生的促进凝血的因子如组织因子以及抗凝因子NO、肝素等，这两类作用相反的因子间能保持一个动态平衡，使血液不致发生凝固而形成血栓[4]；③内分泌功能VEC能通过膜受体途径感知血流动力学变化和血液传递的信号，并在接受物理和化学刺激后，合成和分泌多种血管活性物质，主要有内皮依赖性收缩因子如内皮素、血管紧张素Ⅱ、血栓素A2等以及内皮依赖性舒张因子如NO、前列环素、缓激肽、内皮依赖性超极化因子等[5]；④调节血管张力VEC通过它所产生的扩血管因子即内皮依赖性舒张因子和缩血管因子即内皮依赖性收缩因子实现对血管张力的调控。其中最主要的是内皮素及NO这对拮抗因子。生理情况下，VEC释放的舒-缩血管因子相互作用，处于动态平衡，从而维持正常的血管张力[3]。
2黄芪对内皮细胞的保护作用
2.1黄芪促进血管新生作用
阎维维等[6]进行了黄芪注射液保护血管内皮细胞的实验研究，通过冰浴加肾上腺素复制血瘀模型，检测血液循环内皮细胞数量和血液流变学变化，观察黄芪注射液的作用，结果血瘀大鼠的内皮细胞数量明显增加，全血比黏度增高，血液黏稠度增大，红细胞压积增大、红细胞变形能力下降、聚集能力增高，给予黄芪注射液能减少血瘀大鼠的内皮细胞数量，明显改变血瘀大鼠的血液流变学，结论表明黄芪注射液具有血管内皮保护作用。樊奥光等[7]通过对治疗性血管生成的研究，表明黄芪还可以通过扩张血管，降低区域血管阻力的作用而达到保护血管内皮细胞，改善微循环的作用，并且能够不同程度地促进血管内皮细胞游走与增生，提高内皮细胞表面整合素活性，具有较好地促进血管生成的作用。
2.2黄芪的溶栓作用
王巧云等[8]进行了黄芪注射液对大鼠静脉血栓形成的影响的研究，参照文献[9]形成静脉血栓模型，分别给予不同剂量的黄芪注射液及等量生理盐水，结果发现大鼠静脉注射3个不同剂量黄芪注射液后，与生理盐水组相比，都能明显降低静脉血栓重量，提示药物在体内能对抗静脉血栓形成。其抗栓机制可能与抑制血小板等[10]因素有关。徐先祥等[11-13]进行了黄芪总皂苷抗实验性血栓形成的研究，大鼠经右颈总动脉注射后由ADP、凝血酶和肾上腺素组成的复合诱导剂后形成脑血栓，预先口服黄芪总皂苷的动物具有不同程度的抗血栓形成作用，其机制可能是通过保护血管内皮细胞、增强纤溶功能从而达到抑制血栓形成的目的。
2.3黄芪的抗炎作用
急性冠心病时患者血管内皮炎症病灶中由于炎症细胞的直接（浸润，聚集）或间接（产生细胞因子）作用，引起血管内皮受损，使一氧化氮（NO）功能降低失活，NO很快被分解并释放，大量自由基引起血管痉挛，脂质代谢异常，导致动脉粥样硬化、心肌缺血、缺氧，而使心肌缺血事件发生[14]。黄芪对体内各种炎性细胞因子的表达具有良好的抑制作用，从而在各种炎症相关疾病以及纤维化进程中发挥重要治疗作用。杨沁等[15]进行了黄芪总苷（AST）的抗炎作用及其作用机制探索的研究，采用大鼠角叉菜胶气囊炎症模型，测定渗出液量、中性白细胞游出数、蛋白质、PGE2、IL-8、NO、PLA2含量以及O2-的生成量，结果发现AST40、80mg•kg-1可使角叉菜胶诱导大鼠气囊炎症的渗出液量、中性白细胞游出数、蛋白质含量显著减少，降低渗出液及中性白细胞中PLA2活性，减少渗出液中IL-8含量及中性白细胞O2-的生成。AST也可明显减少渗出液中PGE2、NO的含量。结论表明AST的抗炎作用机理与其降低血管通透性和抑制白细胞游出、降低PL&活性、减少IL-8、PGE2、NO等炎症介质的产生与抑制氧自由基生成有关。肾脏疾病慢性迁延，在肾脏局部表现为肾脏固有细胞和浸润的炎症细胞通过多种炎症因子交互作用。牟娜等通过体外研究高糖刺激人肾脏间质成纤维细胞的实验表明，外源性肝细胞生长因子（HGF）能抑制肾脏成纤维细胞表达TGF-β1，无论是小剂量黄芪还是大剂量黄芪都可以通过促进HGFmRNA及其受体mRNA的表达抑制TGF-β1，起到抗炎抗纤维化的作用[16-17]。
2.4对NO和氧自由基的作用
NO是由内皮细胞合成的具有舒张血管、松驰血管平滑肌、抑制内皮细胞增殖、抑制血小板聚集黏附的作用[18]。冠心病患者存在NO合成酶缺陷，NO生成或释放减少，NO活性降低这是内皮细胞受损的机理之一。陈治奎等通过黄芪对自发性高血压大鼠动脉压力反射敏感性的影响的研究中发现黄芪提取液对血管平滑肌细胞具有诱导NO合酶产生、刺激NO生成的作用[19]。活性氧也是导致VEC损伤的一个重要因素。活性氧即氧自由基主要包括超氧自由基、羟自由基、氢过氧化物自由基、过氧化氢（H2O2）和单氧原子。活性氧包括内源性和外源性氧化性物质，但内源性氧化物质更有意义。内源性氧化物质是在机体代谢过程中产生的，在多种病理条件下，如炎症反应、缺血再灌注损伤等都可以导致氧自由基的大量产生；加之，此时机体对自由基清除能力降低，打破机体氧化-抗氧化能力的平衡，使血液中活性氧含量增加，形成氧化应激状态。同时，活化的VEC也可以产生大量活性氧，成为氧自由基的重要来源[2]。黄芪的主要成分黄芪总皂苷、总黄酮、总多糖均有抗自由基损伤作用，能减少自由基的产生，并促进其清除。
2.5黄芪抗过氧化作用
自由基损伤是肾组织细胞受损的机理之一，黄芪具有肯定的抗自由基作用。体外实验显示，黄芪提取成分对此有良好的清除作用，其中黄芪总黄酮的作用最佳。石勇等[20]通过黄芪多糖对动脉粥样硬化内皮细胞的保护作用探讨黄芪多糖抗动脉粥样硬化内皮细胞损伤的作用，并以卡托普利做标准对照，结果提示黄芪多糖可明显降低血清中总胆固醇、三酰甘油、丙二醛和内皮缩血管肽的含量，从而减轻内皮缩血管肽对血管的损伤作用；同时升高一氧化氮、超氧化物歧化酶及总抗氧化活力，应用黄芪多糖家兔光镜下可见腹主动脉内膜表面基本光滑，内皮细胞形态基本完好，提示其具有较好的对抗氧化损伤和保护血管内皮细胞的功能。
2.6调节内皮素（ET）与一氧化氮（NO）的平衡
以肾脏为例：ET与NO之间动态平衡紊乱对肾脏局部血流动力学异常起着关键的作用，与糖尿病肾病（DN）的发生、发展有关。糖尿病患者24h尿内皮素排泄量显著高于正常人，反映了DN是肾脏合成和分泌ET增多。研究证实，黄芪可以降低胰岛素依赖型糖尿病患者尿内皮素水平。推测黄芪是通过扩张血管、改善血小板功能、改善微循环和抗缺氧等作用使内皮细胞受损功能恢复，减少分泌ET，进而改善肾脏局部血流动力学异常[21]。DN患者血浆ET水平也显著高于健康人，黄芪亦能显著降低DN患者血浆ET[22]。
2.7对血管内皮细胞因子的作用
NO、血管性假血友病因子（vWF）、ET-1等均视为血管内皮功能的标志物，vWF升高反应了血管内皮细胞受损状况，它是冠心病形成发展的一个危险因素，降钙基因相关肽可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内钙浓度降低，冠心病时在患者血中明显下降。已证实通过黄芪注射液的治疗能明显改善冠心病患者血中NO、降钙基因相关肽vWF和ET-1浓度[23-24]，促进血管内皮细胞修复，降低血管张力，从而改善冠状动脉供血。
2.8对免疫系统的调节作用
一般认为，免疫机制是肾小球病的始发机制，在此基础上炎症介质（如补体、细胞因子、活性氧等）的参与，最后导致肾小球损伤和产生临床症状。人类肾小球肾炎免疫学发病机制已得到广泛认可。黄芪多糖不仅能作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体产生，还可以对免疫抑制剂造成的免疫低下有明显的保护作用，是具有双向调节作用的免疫抑制剂。黄芪皂苷的免疫功能则表现在对T淋巴细胞功能的影响。它可使活化小鼠T淋巴细胞内游离钙增加，使Ca2+内流的驱动力增强，而Ca2+作为信息分子，在促进淋巴细胞的增殖分化、IL-2的产生等方面发挥着重要作用[25-26]。这些都对治疗肾脏疾病尤其有利。
关键词：急性胰腺炎肝损伤综述
1病因、临床表现及病理改变
张小平等[2]在一项对185例AP并肝损伤患者的系统回顾性研究中发现胆源性所占比例最高(51.4％)，其次为高脂血症(19.5％)、酒精性(18.4％)、胆源性合并高脂血症(6.0％)、胆源性合并酒精性(4．0％)、酒精性合并高脂血症(5.0％)、暴饮暴食(3．0％)及不明原因(2.7％)。藤晓琨[3]在一项对311例AP肝功能损伤程度对比中发现胆源性因素与高脂血症并存时患SAP明显增加，单因素中胆源性胰腺炎所致肝功能损害的程度最高，而合并高脂血症时肝功能损害进一步加重。肝功能损害程度与AP的严重程度呈正相关。SAP并发肝损伤临床上主要以肝酶学改变为主，伴以总胆红素升高明显的肝细胞性黄疸为特点，肝功能异常出现早，多于发病24h以内即可出现。
2发病机制
2.1胰腺蛋白酶与肝损伤
AP时炎症胰腺组织释放大量蛋白酶，如胰蛋白酶、弹性蛋白酶、脂肪酶、细胞色素P450、溶血卵磷脂等，通过门静脉直接回流人肝脏。在导致肝功能异常中起重要作用。目前研究认为胰弹力蛋白酶在胰外脏器损伤中作用更加重要，MurMM等[4]的研究发现胰弹性蛋白酶能诱导肝Kupffer细胞产生TNF-α，体外实验,氯化钆能显著减少胰弹性蛋白酶诱导的TNF-α的产生，同时Kupffer细胞TNF-αmRNA的表达和NF-κB活性明显降低；体内实验中，抑制Kupffer细胞能减少胰弹性蛋白酶诱导的TNF-α的产生，降低转氨酶活性，减少肝坏死。
2.2肠源性内毒素血症与肝损伤
SAP时因炎症反应液体渗出，肠道组织缺血，再灌注后产生大量氧自由基，使肠黏膜受损，加之AP患者常肠道缺乏食物刺激，肠道屏障功能减弱，肠道内的细菌和内毒素移位，造成内毒素血症，内毒素可促进钙离子从细胞外向细胞内转移，降低细胞外Ca2＋-ATP酶的活性，从而使得Ca2+在胞浆内蓄积而致低钙血症。而Ca2+是重要的细胞内第二信使，低钙血症时其信使功能受损影响很多细胞正常程序，从而造成组织细胞损伤。肝脏巨噬细胞表面存在CDl4、TLR4等多种内毒素相关受体；内毒素还可直接通过激活血清磷脂酶A2(PLA2)破坏细胞膜；激活血管活性物质，导致血管舒缩功能紊乱。引起肝脏的微循环障碍，加重肝损伤。
2.3胰腺炎相关性腹水与肝损伤
急性坏死性胰腺炎时可产生胰腺炎相关性腹水(pancreatitis-associatedasciticfluid，PAAF)，UedaT等[5]利用大鼠腹腔注射PAAF诱导肝细胞损害的研究发现，SAP组在造模2h后肝细胞出现严重的酸中毒、钠超负荷、能量储备下降，而腹腔注射PAAF组虽然没有引起低血压，但也同样导致肝细胞的内环境和储能平衡失调，并且这种损害与暴露的时间有关.
2.4细胞因子炎症介质与肝损伤
（1)TNF-α：目前认为TNF-α
[1][2][3]
在参与SAP病理机制中是最重要的炎性因子之一。有研究发现肝巨噬细胞（KC）介导pMAPK激活核因子-κB(NF-κB),并进一步诱导肝KC产生TNF-α,它与SAP相关肝损伤有一定作用[,]。Malleo等实验研究证实TNF-α是导致SAP炎症反应及休克的最重要因素之一,它可使肝细胞凋亡和坏死,导致严重的肝损伤;而给予药物治疗后,TNF-α表达水平明显下降,且SAP和外周器官损伤程度明显改善。
（)IL-：IL-是一种新的促炎症细胞因子，也是目前研究AP导致肝损伤机制的热点，它在AP的具体生理机制尚未完全明确。UenoN等实验发现。IL-不仅在AP早期即可升高，而且它的表达还会随着AP的病情发展持续增高，IL-在炎症免疫反应中发挥着多种生物学作用，它可增强细胞介导细胞毒性的自然杀伤细胞的作用，诱导Fas配体表达，增加Thl细胞(T辅助细胞)型的表达。
（)IL-：lL-主要作用是诱导产生黏附分子，激活中性粒细胞,使之黏附并脱颗粒，释放氧自由基和蛋白水解酶。作为AP重要的始动因子，IL-可诱导IL-、TNF及其自身分泌。
研究发现在内毒素应激下,Kupffer细胞能产生IL-,介导肝细胞合成细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子(CINC),促进中性粒细胞在肝组织中的聚集和中性粒细胞弹性蛋白酶的释放，进而引起肝损伤。
（)IL-：IL-是重要的抗炎介质，其主要作用是抑制巨噬细胞向型辅助性T细胞(Thl细胞)呈递抗原，减少巨噬细胞主要组织相容性复合物类分子(MHC-)的表达,从而抑制细胞因子,包括TNF-α、IL-β、IL-、IL-等的合成。
（)IL-：IL-是一种主要由中性粒细胞产生的强有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子,它由单核／巨噬细胞、内皮细胞产生，具有诱导T、B细胞分化，增强NK细胞杀伤靶细胞，促进吞噬等功能，在中性粒细胞介导的组织损伤中起重要作用，目前认为TNF-α、IL-、L-诱发的炎症反应很大程度上是通过诱导以IL-为代表的趋化因子的产生而实现的。
（)一氧化氮(NO)：NO在AP导致肝损伤中的作用尚有争议。目前多数研究认为它在AP导致肝损伤的作用呈双向作用。过量的NO产生，可致血管过度扩张，使胰腺及肝脏呈低灌注状态，致肝脏血循环障碍及造成缺血-再灌注损伤；另外NO为血管舒张因子，适量的NO可通过调节肝脏血流而起到保护肝脏作用。
（)NF-κB：NF-κB是AP发病、介导肝等脏器损伤的研究新热点。MurrMM等朝通过体内、外实验研究发现，Kupffer细胞介导pMApK、ERKI／和SAPK／JNK磷酸化、激活NF-κB以及相关炎性细胞因子的表达均具有时间依赖性，TNF-amRNA、FasLmRNA等的峰值随上述几种物质峰值的出现而出现，但减退时间相对滞后，表明NF-κB在AP时细胞因子基因表达中起中心作用，可能是细胞因子级联反应的重要开关。
.细胞凋亡与肝损伤
目前越来越多的研究表明，SAP发生时的肝细胞凋亡可能是导致肝功能损伤的重要原因。TNF-α等细胞因子在细胞凋亡中的作用已较明确。PAAF诱导的肝损伤和肝细胞凋亡主要是通过激活p-促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和半胧氨酸蛋白酶-(caspase-)依赖的促凋亡途径来发挥作用。
治疗
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上世纪末，Janeway提出病原体相关分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs）和创伤后组织细胞裂解物的损伤相关分子模式（damageassociatedmolecularpatterns，DAMPs），以及机体相应的模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRRs）[4]，为研究创伤后SIRS的发病机制提供了重要的理论基础。在SIRS发展到MODS的病理生理过程中，创伤、感染等因素使大量DAMPs、PAMPs进入血液循环[5]，激活巨噬细胞、中性粒细胞等固有免疫系统的效应细胞[6]，引起循环中的细胞因子风暴，免疫系统激活的程度与细胞因子的浓度相关[7]。细胞因子风暴进一步激活固有免疫系统，加剧组织细胞损伤，组织细胞损伤释放更多的模式分子激活更多的固有免疫细胞[5]，产生更多的细胞因子，如此恶性循环，最终出现器官衰竭甚至死亡[2]。其中炎症反应的启动及维持是关键机制。本文就SIRS的分子启动机制进行综述。
免疫系统必需在微生物侵入时区分自体细胞与病原体，区分自体细胞是否死亡，为此人体已进化出完善的监督/防御/修复机制。这套机制包括危险信号的识别、相应细胞的激活、局部及全身炎症反应的启动[8]。来自病原体本身的PAMPs是典型的危险信号。在生物与环境长期的相互作用中，机体固有免疫系统识别的PAMPs往往是种系高度保守且病原体赖以生存的结构，如革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）、革兰氏阳性细菌的脂多磷壁酸（LTA）、细菌未甲基化的CpG-DNA及细菌甲酰化蛋白（FPP）等，因此病原体很难产生突变而逃脱固有免疫系统。机体免疫细胞的PRRs能够特异性结合病原体自身携带或释放的PAMPs，从而启动炎症反应，引起机体防御和修复反应[9，10]。
针对不同的PAMPs，目前已发现至少6类PRRs，包括TLRs（Toll-likeReceptors），NLRs（NOD-likereceptors），RLRs（RIG-I-likereceptors），CLRs（C-typelectinreceptors），AIM2LRs（absenceinmelanoma2-likereceptors），FPRs（formyl-peptidereceptors）[11]。其中TLRs家族识别的配体多（能识别LPS，PepG，LPA，CpGDNA，细菌RNA等），作用广泛，处于核心地位[12]。越来越多的证据表明TLRs除识别微生物PAMPs外还识别多种内源性DAMPs，如损伤、坏死细胞释放的HSPs、HMGB1、线粒体甲酰化蛋白、线粒体DNA、S100蛋白以及透明质酸、硫酸肝素及蛋白聚糖等细胞外基质的组分。FPRs可以特异性识别甲酰化蛋白，对于细菌性感染启动的SIRS具有重要意义[13]。长期的进化使PRRs具有进化的高度保守性、分布的广泛性、识别配体的多样性、信号转导的复杂性及其介导生物活性的两面性等[14]。
创伤是导致SIRS的常见致病因素。机械暴力使组织被牵拉、挤压、撕裂。此外冷、热、化学物质、毒素、放射线、缺氧均可损伤组织，同样引起炎症。病原体与创伤所致免疫反应相似，实际上在漫长的进化过程中二者对机体的意义是等同的：病原体可以轻易突破伤口，因而创伤通常继发感染；创伤和感染均导致组织细胞的损伤，因此触发相同的反应。
严重创伤后病原体感染或肠道菌群、毒素移位入血一度被认为是导致机体SIRS和MODS的主要因素。但绝大部分SIRS患者并不伴有细菌感染，提示细菌感染并不是导致创伤后SIRS的唯一致病因素。越来越多的研究发现，创伤和病原体诱发的机体SIRS临床表现完全一致[15]，但创伤后SIRS大部分没有并发感染。因此，学者们推测一定有一种内源性PAMPs类似分子参与创伤后机体炎性反应[16]。目前已经明确，创伤后组织细胞破裂，释放具有免疫活性的内源性物质，产生与PAMPs分子类似的作用，特异性结合PRRs受体，激活机体固有免疫系统，导致组织器官进一步损伤。Bianchi等将标志着组织和细胞损伤的这种内源性PAMPs分子定义为警报素（alarmins），PAMPs与警报素合称DAMPs[8]。但这一概念演变至今，多数学者用DAMPs代表警报素，以便与PAMPs区分。
PAMPs及DAMPs均特异性结合PRRs，激活下游多种信号通路，如NF-κb、MAPK及干扰素I型通路，导致对炎症及抗微生物反应中有重要意义的前炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的合成与释放。这些细胞因子在释放到细胞外后，可通过相应受体令下游细胞合成包括这些细胞因子在内的多种炎症介质，从而放大炎症反应[17-19]。炎症反应过度则损伤组织细胞，释放更多的DAMPs，诱发细胞因子级联瀑布样释放，出现细胞因子风暴，形成失控性炎性反应，导致远隔器官损伤和多器官功能衰竭。因此循环中PAMPs及DAMPs这些模式分子和高浓度的TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子是SIRS的启动及维持因素。
创伤代表了人体组织最极端的损害，其继发的SIRS目前认为属于无菌性SIRS[20，21]，启动因素尚不完全明确。DAMPs的判断标准应包含以下几点：组织细胞坏死而非凋亡时释放，在细胞水平能激活炎症相关通路使固有免疫、获得性免疫应答[22]，在受体水平阻断后可阻断免疫反应，创伤后在循环中浓度升高；以临床浓度应用于动物可以引发SIRS[22-24]。迄今发现的DAMPs来源大致为坏死细胞和细胞外基质碎片。其中源于坏死细胞的典型DAMPs有核相关产物HMGB1，应激蛋白HSPs，嘌呤代谢产物ATP、尿酸，线粒体相关产物甲酰化蛋白、线粒体DNA。细胞外基质来源的DAMPs有透明质酸、硫酸肝素、二聚糖等[11]。促进组织修复、重塑所激活的蛋白酶及细胞损毁后释放的可水解蛋白的酶类水解酶切细胞外基质，形成这些细胞外基质来源的DAMPs[25，26]。在啮齿类动物中这些分子通过TLR4活化下游的炎症通路[19]，起到了DAMPs的作用，具备生物活性，参与凝血过程[26]，但在人体创伤后SIRS中所起作用有待进一步研究。
从临床角度上说，目标是找出创伤致组织损害后第一时间释放的警报素，即激活第一个免疫细胞的分子。此警报素在细胞外的浓度应反映创伤的严重程度。迄今为止的研究中，HSPs，HMGB1，线粒体甲酰化蛋白、线粒体DNA这4种DAMPs最符合前文所述“第一警报素”的标准。
HMGB1是一种核结合蛋白，存在于所有真核细胞核内；线粒体甲酰化蛋白及线粒体DNA均位于线粒体内部，生理情况下此3种DAMPs均与细胞外环境隔绝。HSPs是从细菌到哺乳动物中广泛存在的一种热应激蛋白，细胞应激后能大量表达于细胞表面。动物创伤模型中HMGB1及HSPs在细胞表面表达上调[27，28]，体外实验及动物创伤模型已证实HSPs及HMGB1通过TLR4激活炎症反应[28-30]，但是尚不清楚是单一受体还是多受体协同作用；线粒体DNA通过TLR9、线粒体甲酰化蛋白通过FPR1及FPRL1发挥作用[31，32]。创伤动物模型中发现循环中的HMGB1、HSP、线粒体蛋白及线粒体DNA水平均增高[31，32]。临床研究发现损伤病人HSPs、HMGB1、线粒体蛋白、mtDNA、核DNA水平增高[33-36]，伤后32分钟HMGB1水平与ISS评分、碱缺失相关，与炎性介质水平及补体激活水平相关[35]。HMGB1是迄今发现的唯一与免疫激活程度相关的DAMPs。循环中核DNA水应创伤的严重程度，与临床结局相关[34]。临床病人的血浆内线粒体甲酰化蛋白浓度与炎症水平的相关性尚无文献证实。但HMGB1及HSP可能需要预先结合PAMPs如LPS后才能激活免疫细胞，并且HMGB1在创伤后中晚期水平增高[27]，因此不太符合前述第一警报素的特征。
从现有的研究分析，源于线粒体的DAMPs最符合第一警报素的特征。动物实验证实临床水平的线粒体可溶性碎片经大鼠尾静脉注射后能诱发系统性炎症，进一步研究发现主要活性物质是mtDNA及线粒体甲酰化蛋白，二者均可激活循环中的中性粒细胞，引起系统性炎症[5，37，38]。有研究发现线粒体甲酰化蛋白通过甲酰肽受体（FPR）激活单核细胞，而坏死细胞中非线粒体细胞成分无显著活性。临床研究发现重度创伤病人血浆mtDNA平均浓度2-9?g/ml，是健康对照组的1000倍[5]，但mtDNA水平是否与损伤严重程度相关还未经证实。
从细胞进化角度来看，线粒体与细菌同源。线粒体是由saprophytic菌进化形成的内共生细胞器，结构特征与细菌一致，完全不同于真核细胞，其独立的基因组（mtDNA）富含CpGDNA重复序列（CpGDNArepeats），编码甲酰肽[39]。生理状态下线粒于胞浆，与免疫系统隔绝，细胞破损后线粒体进入细胞外，则被免疫系统错认为细菌，启动杀伤机制，因此有学者称线粒体为人体的“内敌”、“特洛伊木马”[5，17]。从机体进化角度来看，创伤后细胞重新使用自身成分，把线粒体作为信号分子介导细胞对损伤产生应答，激活固有免疫系统，促进机体修复，使资源利用达到最大化，是自然选择的必然。因此，线粒体成分作为一种特殊的DAMP，组织细胞破裂后释放入循环，可以解释创伤后即便在没有发生感染的情况下，也会发生与感染相似的无菌性SIRS。
创伤及感染释放DAMPs及PAMPs入血，通过PRRs激活固有免疫细胞的下游通路，产生大量细胞因子，高浓度的细胞因子令免疫细胞进一步产生细胞因子，同时杀伤组织细胞，循环中产生更多的DAMPs。致炎细胞因子及DAMPs在循环中互为因果，浓度进行性升高。循环中DAMPs、PAMPs这一触发因素持续存在，令炎症反应无法停止；循环中的模式分子、细胞因子、炎症介质互为因果，形成级联网络，使炎症反应进一步失控，致炎因子与抗炎因子均同时存在，出现代偿性抗炎反应综合征（compensatedanti-inflammatoryresponsesyndrome，CARS）或混合性抗炎反应综合征（mixedanti-inflammatoryresponsesyndrome，MARS），进而出现MODS。高细胞因子血症、高DAMPs血症可能是创伤后SIRS的关键启动机制，去除循环中的模式分子及致炎细胞因子有重大临床意义。系统性炎症反应救治的焦点在于如何控制循环中启动、维持免疫反应的细胞因子、炎症介质及模式分子，打断炎症过度反应的恶性循环。普通方法无法去除血液中的这些危险分子，临床实践证明大剂量广谱抗生素疗效甚微，既往应用细胞因子及炎症介质的抗体、受体拮抗剂均未取得明显效果。血液净化疗法可以通过透析、滤过、灌流、吸附等方法清除循环血内已知及未知的中大分子蛋白质、毒素，包括细胞因子、炎症介质，精确维持水电解质及酸碱平衡，给SIRS及MODS的治疗带来新的曙光。
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线粒体在细胞能量代谢、细胞死亡调控、神经递质合成、脂肪酸氧化等过程中发挥重要作用。线粒体在氧化磷酸化过程中可产生一定量的自由基,但由于生物体内同时存在抗氧化防御体系,在生理条件下可维持动态平衡。如果这种平衡被破坏,线粒体损伤可引起一系列的细胞功能障碍,参与疾病的发生、发展过程。氧化应激损伤线粒体参与肺纤维化的形成日益受到重视。
1线粒体结构和功能
线粒体是真核细胞的重要细胞器,线粒体有内外两层膜封闭,包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。
线粒体外膜包含目前研究最广泛的线粒体通道:电压依赖性阴离子通道(Vohage-depedentanionchannel,VDAC)。外膜上的孔道是细胞凋亡的基本要素[1]。研究发现,在细胞凋亡的过程中发现细胞色素C从线粒体间膜转移到细胞质。线粒体内膜通透性小,通道包括:Ca2+单向转运通道、通透性转孔、去偶联蛋白、KATP、Kca、内膜阴离子通道。
线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2+、能量代谢、抗活性氧等重要生理作用。是细胞内氧化应激的源头,也是细胞凋亡的主要位点。
2线粒体损伤性改变
数量的改变:线粒体的平均寿命约为10d。衰亡的线粒体可通过保留的线粒体直接分裂为二,予以补充。在病理状态下,线粒体的增生实际上是对慢性非特异性细胞损伤的适应性反应或细胞功能升高的表现;线粒体数量减少则见于急性细胞损伤时线粒体崩解或自溶的情况。
大小改变:最常见的是线粒体肿大,分为基质肿胀和嵴型肿胀,以前者为常见。结构改变:线粒体嵴是能量代谢的明显指征,嵴和酶的平行增多反映细胞功能负荷加重,为一种适应状态的表现;反之,如嵴的膜和酶的增多不平行,则是细胞浆适应功能障碍的表现,此时细胞功能并不升高。
3线粒体氧化应激与细胞内氧化应激
线粒体氧化应激即发生在线粒体内部的氧化与抗氧化失衡。一般认为,线粒体内氧化应激的发生早于细胞内氧化应激。线粒体是ROS的主要产生部位,体内ROS的损伤作用主要由超氧阴离子(O-2)介导,线粒体中O-2主要在呼吸链中产生,包括:①QH是还原型辅酶Q和氧化型辅酶Q的中间产物,呼吸链复合物Ⅲ中的QH可氧化生成O-,这是线粒体中O-2的主要来源;②PKA磷酸化复合物I可使O-2生成增加;③呼吸链中的FAD和FMN在氧化还原反应中产生的半醌自由基可以将一个电子交给O2生成O-2;④生物体内产生的H2O2,如果未能及时清除,则可与过渡金属离子或其他化合物,如ADP-Fe(Ⅱ)反应,产生O-2[2]。线粒体也可生成多种RNS。线粒体一氧化氮合酶(mitochondrialnitricoxidesynthase,mtNOS)催化L-精氨酸生成NO,由于内环境不同,NO可衍生成NO+和NO-,NO和O-2相遇即可生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。ONO-是一种活性很强的自由基,它的性质和OH-近似。
4线粒体氧化应激与细胞凋亡
细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD),是指机体在生理或病理条件下,启动自身内部机制,经过多途径的信号传递,结束其自身生命的过程。已知有三条信号通路,其中线粒体凋亡通路细胞凋亡的“中心执行者”[3],线粒体的功能是作为凋亡途径上游与caspase、下游死亡执行器之间连接。凋亡过程中线粒体内发生的最重要事件即其结构和功能的改变,由此产生凋亡相关蛋白释放到胞质[4]。线粒体内膜含有许多促进凋亡因子(deathprovotingfactor,DPF),包括细胞色素C(cytC)、AIF和半胱氨基酸蛋白酶(caspase)等。在氧化应激状态下,气道上皮细胞线粒体膜极性破坏,通透性增加,并且释放细胞色素C和凋亡诱导因子至胞浆中,在ATP的参与下细胞色素C与凋亡蛋白水解酶活化因子(Apaf-1)结合,使Apaf-1之间相互聚合,并与caspase-9前体形成复合体(即凋亡小体),从而激活caspase-9,活化的caspase-9再激活下游的caspase酶原-3、caspase酶原-6、caspase酶原-7等效应酶,并释放细胞色素C进而诱发凋亡反应形成凋亡小体;同时,AIF从线粒体膜间隙首先转移至细胞质,继而进入细胞核激活DNAase,促使DNA裂解成片段和胞核中的染色质异常凝集[5,6]。从而出现细胞膜破裂、细胞皱缩及分解等凋亡形态[7,8]。
4.1线粒体通透性转换孔的改变线粒体通透性转换孔(Mitochondrionpermeabilitytransitionpore,MPTP)被称为细胞生死开关,是由电位依赖性阴离子通道即孔蛋白(porin)、腺苷酸移位酶(Adeninnueleotidetransloease,ANT)及亲环素D(cyP-D)复合物在内外膜交接处构成的一种孔道复合结构。ANT位于线粒体内膜,VDAC位于线粒体外膜,CyP2D存在于线粒体内室。VDAC和ANT并置在线粒体内外膜的相对应接触位点上,它们三者通过相互之间的亲和力,而连接成一个稳定的复合体结构。Boya等研究发现PT是许多凋亡通路的关键步骤[9]。PT孔可导致线粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶联、ATP合成下降、线粒体内膜电位丧失、Ca2+外流、还原性谷胱甘肽和NADPH2减少、细胞内活性氧增多、凋亡诱导因子(apoptosisinducedfactor,AIF)和细胞色素C释放,从而启动细胞凋亡程序,激活细胞内核酸内切酶、蛋白酶,发生细胞凋亡[10]。目前研究认为,线粒体PT孔的开放是引起细胞凋亡发生的直接原因。PT孔主要是通过线粒体内膜电位的变化、氧化应激和激动剂与拮抗剂之间的相互作用来进行调控。Ca2+、Pi、自由基等氧化因子、Bcl-2、Bax、等可以诱导PT孔开放,自由基则作用于ANT的硫醇并使之氧化,从而引起PT孔开放[12]。
4.2ROS细胞内活性氧(ROS)来源于两条途径:黄嘌呤氧化酶途径和线粒体呼吸链途径。在病理条件下线粒体呼吸链是产生ROS的重要源泉。Haworth和Hunter发现ANT含有硫醇结构,过氧化物可能通过氧化MPTP孔上的硫醇而诱导MPTP开放[12]。孔道中-S-S-和-s-As-s-结构导致MPTP开放,-SH2和-SH则使MPTP关闭。Ding等认为,ROS可能是通过氧化MPTP上的2个氧化还原敏感位点:二硫键部位(可能是GSH库);吡啶核苷酸库,(NADH或NAD+)和(NADPH/NADP+)。还有一种可能的机制是ROS作为第二信使通过Capase和Bcl-2调控MPTP。MPTP开放时,由于其孔径较大,不仅允许质子在膜两侧达到平衡,也允许呼吸链作用的底物在细胞质与基质间达到平衡。跨膜质子梯度的崩溃使呼吸链的呼吸速率达到最大值,快速消耗氧导致活性氧产生下降和MPTP的关闭。病理条件下氧自由基生成增加,过高的ROS持续积累导致MPTP的持续开放。
4.3Bcl-2、Bax基因及相关蛋白Bcl-2基因家族是细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用的基因家族,其中Bcl-2、Bax是该家族中最具代表性的抑制和促进气道上皮细胞凋亡的基因。Bcl-2基因又称凋亡抑制基因,是从滤泡性非霍奇金淋巴瘤细胞中分离出来的一种癌基因,主要分布于线粒体外膜的胞浆面。人Bcl-2蛋白由4个Bcl-2同源结构域(BH1～BH4)、α2螺旋环(loop)和跨膜锚定区(TM)构成。正常情况下,Bcl-2发挥蛋白降低线粒体膜通透性的作用。机制如下:①作用于膜通透性转运孔(PT孔)的有关蛋白,阻止PT孔的开放及线粒体内物质的外流;②抑制细胞内Ca2+的重新分布,以阻断某些因素的促凋亡过程;③转变成完整的膜蛋白,参与细胞色素C的释放:④作为一种抗氧化剂,调节细胞氧化还原状态,阻断氧化作用对细胞组分的破坏[13]。但Bcl-2蛋白的量与线粒体ATP产量正相关。线粒体内发生氧化应激时,其ATP产量明显下降,导致Bcl-2蛋白量明显降低,线粒体膜稳定性下降。
Bax:即Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2associatedproteinX),是第一个从有t(14;18)易位的人B细胞中发现的与Bcl-2共免疫沉淀的蛋白。Bax蛋白包含Bcl22家族结构特征的BH1、BH2和BH3及C末端的跨膜结构域,不含BH4结构域。Bax蛋白在细胞内膜、细胞浆和细胞核均有分布[4]。与Bcl-2的同源性为40%,故称Bax为Bcl-2家族成员,普遍认为Bax作用于线粒体,增加其外膜通透性。Bax通过调节预先存在的PT孔参与调节线粒体的功能。研究发现,,静止的Bax蛋白从胞浆转位到线粒体而被激活,使PT孔开放并增大到一定程度,导致线粒体的通透性增加和跨膜电位(φ)消失,并且释放细胞色素C和AIF到胞浆,而AIF则转移到核内使染色质异常凝集和DNA裂解成50kb的片段[14]。Bax作用于PT孔还参与调节线粒体基质中Ca2+、pH值、电荷等的改变和活性氧自由基生成增加,影响呼吸链的正常运行。当Bax大量表达时,细胞对凋亡信号的反应增强,细胞凋亡增多,因此Bax被称为“死亡激动剂”。它本身可以形成多量的Bax-Bax同源二聚体,亦可以和Bcl-2形成异源二聚体Bax-Bcl-2。业已证实细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了细胞凋亡的发生,Bax同源二聚体的形成可诱导和促进细胞凋亡,随着Bcl-2蛋白表达量的升高,越来越多的Bax二聚体分开,与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体,从而“中和”了Bax诱导凋亡的作用。Bax与Bcl-2形成的Bax-Bcl-2异源二聚体在诱导细胞凋亡启动过程中起制动作用,可抑制Bax的生物活性,保护细胞不发生凋亡。氧化应激时,Bcl-2蛋白量随着ATP生成的减少而降低,引起Bcl-2与Bax的比例变化,导致线粒体膜通透性改变。
5氧化应激、细胞凋亡与肺纤维化
肺纤维化以肺泡上皮细胞和内皮细胞凋亡导致肺泡结构的破坏和成纤维细胞增生为特征,目前认为其主要机制为氧化应激和肺泡Ⅱ型细胞凋亡。
细胞凋亡在多种组织器官的发生发育、细胞分化和维持机体平衡状态中发挥重要作用,并参与许多疾病的发生和发展过程。成纤维细胞和内皮细胞凋亡对于急性肺损伤修复十分重要,肺泡上皮细胞凋亡与弥漫性肺泡损坏密切相关。肺纤维化以肺泡上皮细胞和内皮细胞凋亡导致肺泡结构的破坏和成纤维细胞增生为特征。肺纤维化过程起始于肺泡,其肺泡上皮细胞损伤、肺泡炎可能是疾病的早期事件。最近的研究显示,肺泡上皮细胞凋亡在肺炎症/肺纤维化的发生与发展中可能起重要作用。在体内,电镜及DN段末端标记证实特发性肺纤维化患者的肺泡Ⅱ型细胞凋亡明显增多,直接导致肺泡塌陷,加速肺纤维化的进展。在体外,活性氧(ROS)和caspase23介导诱导人肺泡I型样细胞WI226、人肺泡II型细胞和大鼠肺泡II型细胞凋亡。
病理情况下,ROS产生的速率大于被清除的速率时,就造成活性氧的蓄积,导致氧化应激,从而引起生物膜磷脂中的多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应、细胞内蛋白及酶变性、DNA氧化损伤;ROS还可作为重要的细胞内信使,活化多条信号转导通路,间接引起组织、细胞损伤。ROS在细胞损伤中发挥重要作用已成定论。ROS可直接或间接作用于细胞,改变其细胞膜和亚细胞器的结构使其变性、坏死造成细胞损伤、坏死、凋亡及组织炎症反应,产生大量的炎症介质及细胞因子,导致纤维化改变,另一种可能机制为ROS可通过一系列途径直接导致EMS合成增加。
6结语
综上,线粒体是凋亡的决定性环节,也是细胞内氧化应激的源头,因此其在肺纤维化的形成过程中扮演着重要的角色。但是国内外有关线粒体和肺纤维化的关系的研究报道甚少,关于纤维化早期导致线粒体功能和结构改变以及二者的相互作用和影响机制也有待进一步研究。
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组织工程的基本含义是单用或将细胞、细胞因子和生物材料复合以后应用于体内的活组织再生和体外的组织构建。作为医学组织工程的重要组成部分，骨组织工程是针对骨不连骨缺损，特别是大块骨缺损(内径>5mm)的填充和愈合这一临床难题，研究有效的治疗途径。它的研究思路是在体内骨不连或骨缺损处植入载有高效成骨种子细胞的载体系统，提供骨诱导与骨传导的最佳环境，在局部直接成骨并完成骨愈合过程。上世纪60～70年代人们对骨生长因子——骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)认识的深入，开辟了骨组织工程研究的新纪元。在骨组织工程研究早期，人们主要把精力放在种子细胞的培育，寻找适合种子细胞生存的载体和设计载体的空间结构上面。近年来的研究证实，影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化，组织工程骨的血管再生在其自身存活及与宿主床的愈合中发挥着重要的作用。就组织工程骨而言，快速血管化可以为成骨细胞功能活动提供充足的营养，决定成骨量的多少，同时只有血管化人工骨才能演变成自体骨，从而在体内发挥持久的生理功能。因此，提高组织工程骨的血供，构建微血管化的组织工程骨已成为目前研究的热点。
1成骨种子细胞的来源与选择
种子细胞是骨组织工程研究中最基本的环节。从细胞分化的角度看，机体的成骨效应主要来源于两类细胞，即确定性的成骨祖细胞(DOPC)和诱导性成骨祖细胞(IOPC)。DOPC是成骨细胞分化的高级阶段，有活性的DOPC成骨活力高而且稳定，是种子细胞培育的金标准。DOPC在体内主要存在于骨膜内和骨髓内，纯化的DOPC获得十分困难，在实际中难以办到。骨组织工程所应用的种子细胞主要来源于诱导性成骨祖细胞(IOPC)。它们主要来源于中胚层组织，如骨髓基质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等。骨髓是机体唯一同时含有DOPC和IOPC的组织，骨髓基质干细胞取材方便，对组织损伤小，成骨细胞活力高，体外状态下容易扩增，便于诱导，是目前骨组织工程研究最多而且最有应用价值的种子细胞来源。目前亦有采用异体骨髓基质细胞进行移植研究的报道。骨髓基质干细胞近期有待于获得FDA认证后正式应用于临床。骨膜内有大量确定性的成骨祖细胞(DOPC)，在体外状态下容易扩增，成骨活力很高，也是很好的种子细胞来源，但是由于需要切开取材，目前仅停留在动物实验方面。有人提出大范围创伤病人在处理创伤的同时进行取材，体外培养，深低温保存，以备将来使用，是一个很好的思路。胚胎干细胞作为种子细胞极易被诱导体诱导向成骨细胞方向分化，成骨潜力极大。有人提出建立骨组织工程种子细胞库的设想，但是由于来源和免疫原性使之在应用方面受到限制。其它干细胞，包括脂肪干细胞、肌源性干细胞等，目前已经从不同的成熟组织中获得了其相应的干细胞，并在体外状态下诱导显示了这些细胞有很高的成骨活性，在临床上潜在的应用价值，由于这些细胞取材、分离和分化的操作程序复杂，以及其免疫原性，而限制了它们的应用。其它成熟细胞虽然在病理状态和在科学实验中发现了它们的成骨分化，但是作为骨组织工程的种子细胞来源将不予考虑。
2种子细胞的成骨诱导与分化
通过成骨因子或细胞因子诱导IOPC的成骨分化，仍然是目前获取高效种子细胞的主要手段。BMP2是最有效最方便的成骨诱导因子，此外，尚有BMP3、BMP7诱导分化的报道。目前，FDA已经通过了将重组人BMP应用于临床的决议。为了提高和维持种子细胞的成骨活力，生长因子网络的作用越来越受到重视，双因子，如BMP2与bFGF或三因子的共同刺激骨髓基质细胞已获得了很好的增值与成骨分化。细胞因子仅在体外状态下实施诱导，可以获取高效的种子细胞，由于尚未发现较好的细胞因子缓释载体，如果将细胞因子直接植入体内，将很快被周围血流带走，或被周围细胞处理，难以发挥有效的成骨诱导作用，因而将其单独用在体内诱导的思路不可行。
通过基因工程手段将高效成骨因子基因装入真核表达载体后转染成骨细胞，植入体内可以获得高效成骨细胞因子的稳定表达，可以维持其在成骨区浓度，使稳定成骨成为可能。目前常用的真核表达载体有质粒载体，如pcDNA3、逆转录病毒载体，如pDor、及腺病毒、慢病毒表达载体，比较有优势的是后两种载体。人们已将多种目的基因装入载体均获得了较好的表达，但是，这种方法表达细胞因子蛋白的三、四级结构、表达量以及表达时间尚不能控制，影响成骨过程。此外上述载体存在一定的细胞毒性，而未获得医疗监管部门的批准，尚未进入到临床应用阶段。
3骨组织工程载体的选择与应用
经典的载体设计理念仍然有指导意义。即骨组织工程载体应具有：(1)一定支持力和结构强度的材料作为核心骨架，降解缓慢，以提供有效的成骨空间和时间;(2)利用天然孔隙或不同工艺段造形成的孔隙，仍以100～500μm直径为好，以提供良好的骨传导性;(3)通过载体的表面修饰增强对种子细胞的相容性和粘附性，以提供良好的成骨环境和首次贴壁率;(4)植入体内骨组织工程支架材料及其降解产物不会刘丹平:骨组织工程研究现状与展望辽宁医学院学报2009年10月，30(5)引起炎症及不良反应。目前，尚未发现一种材料同时具有上述的各种性能。
从材料来源分类可将支架材料分为天然材料和合成材料两大类。天然材料中以牛松质骨载体为代表，牛松质骨经过去抗原处理(主要是脱脂、脱蛋白、去细胞)后，可形成孔隙均匀，相互贯通，强度较佳的载体。可以打磨成任意形状，由于属生物材料，组织相容性好。我国第四军医大学胡蕴玉教授课题组研制的以去抗原牛松质骨载体为核心骨架的重组合异种骨已应用临床。此外经过处理的异体骨和天然珊瑚(羟基磷灰石)材料在临床上亦已有应用。
在人工合成的无机材料方面，羟基磷灰石虽强度和组织相容性较好，但无骨诱导活性，并且目前的工艺难以制作成均匀的孔隙和达到相应的孔隙率。磷酸三钙的组织相容性很好，但强度较差，在体内易于松散并降解粉化，孔隙难以维持。近年来由于制作工艺的改进新近发展起来的纳米磁性磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷(apatite-wollastonite-magneticbioactiveglass-ceramic，A-WMGC)载体展现了良好的应用前景。我们与四川大学联合协助研制了磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷载体，改变传统的熔融制备法，而采用溶胶-凝胶法制备工艺制备的磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷具有纳米晶结构并磁性化，可保证材料表面微环境的可调性。我们将载体的孔隙直径设为300～500μm，孔隙率可达到60%，既增加载体内孔隙弯曲度和孔隙之间的再通率，减少载体内大体积腔隙的形成，便于细胞在载体内的填充分布，又为细胞粘附提供更为广大的面积。它具有良好的生物相容性、骨传导诱导性和机械强度。在体外状态下，我们已经获得成骨种子细胞在该载体内的大量生存、繁殖，并有胶原蛋白的表达。A-WMGC载体的特点是：(1)可直接诱导MSC向成骨细胞分化;(2)静磁场可产生弱电流，促进“静止”状态的原始细胞分化;(3)成骨细胞可直接在其表面成骨，即细胞在其表面分泌类骨质可直接钙化，而不形成一层结缔组织膜;(4)其降解速度低于β-TCP，避免了过快降解产生的“粉渣淤滞”现象，并且其降解过程中产生的钙磷富集层(Ca-Prichlayer)可被成骨细胞直接利用成骨。
以聚乳酸(PLA)、聚乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)等为代表的高分子材料的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。这些材料具有良好的生物相容性、可降解性、可吸收性、材料的吸收率可以通过共聚单位的相关比例来控制等优点。有报道在骨组织工程研究中它们亦具有良好的成骨效应。但是其酸性降解产物和聚合物中可残留有机溶剂易引起无菌性炎症反应和周围组织的纤维化，机械强度不足。此外，材料表面缺乏细胞识别信号与细胞间缺乏生物性相互作用，令人不能满意。
4骨组织工程核心骨架材料的表面修饰
上述的骨组织工程核心骨架材料均具有良好的组织相容性，但缺乏种子细胞的黏附性。这些材料表面“干枯而贫瘠”，在体外状态下难以为种子细胞提供生存的“土壤”，故多数载体均需进行表面修饰。目前用于表面修饰的材料主要有胶原材料和壳聚糖及其衍生物。壳聚糖的分子结构与细胞外基质糖氨聚糖相似，在体内降解产物为N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，对人体无毒，其他降解产物(如甲壳素或其寡聚糖)分子量相对低，在体内不积累，无免疫原性，因此有良好的生物相容性，可控的降解性，无毒副作用。有研究表明壳聚糖能促进前成骨细胞的分化增殖，并具有缓释和抑制炎症反应的作用。此外，还有多聚赖氨酸和人工合成的多肽可用于表面修饰，这些材料仅用于科学实验。
5改善骨缺损区血供状态
充足的血液供应是维系骨缺损、骨不连局部骨再生的必要条件。在临床实际工作中，大块状骨缺损多由于严重的车祸、重物砸伤或爆炸引起，损伤段的骨块可由于过于粉碎，严重污染而不能回植应用，甚至损伤段的骨块散落于骨折发生现场而无法找回。此类骨折临床治疗多采用二期植骨。此外还有一类骨缺损由感染造成，或由于慢性骨髓炎一般细菌感染骨块摘除遗留的骨缺损，或由于骨结核坏死骨块由窦道排出。骨缺损区血供馈乏主要有两个原因，其一骨缺损区两端骨质已硬化，骨髓腔封闭;其二骨缺损周围组织已经严重的纤维瘢痕化，血管再生能力较差。此外，目前的骨组织工程载体孔径多为100～700μm，孔隙率一般在50%～70%。大量的观察发现，无论在体内还是体外与成骨种子细胞组装，也无论这些载体做成骨粒状还是做成大块状(内径>5mm)填充骨缺损，在植入体内早期载体周围被结缔组织挤压和积血块包裹，局部仅依靠组织液渗入获得营养，特别是骨缺损中心部位或植入的大块状载体中心部位组织液流动就更为缓慢，氧分压更低，营养物质供应严重不足，致使此部位成骨活动缓慢以至停滞，甚至连种子细胞生长的基本营养需求都不能满足。
解决上述问题的关键是尽快在骨缺损区或载体的中心部位构建有效的血管网来支撑成骨过程，这是骨组织工程研究的一个新热点。机体血管的形成有血管生成(已有的毛细血管生芽并爬行生长)和血管形成(干细胞分化成血管内皮细胞后再聚集形成毛细血管)两种方式。骨缺损区内植入的载体内的血管形成上述这两种方式均可发生，但以何种方式生成血管为主，以骨缺损周围软组织和髓腔内血供条件为前提，软组织越新鲜、再通的髓腔血供越丰富，毛细血管生芽爬行就越快;目前骨组织工程学在骨缺损区内血管构筑研究方向的理想模式是促进新生毛细血管尽快再生，还要使之进一步增粗、加厚和固定，即微血管化，形成包括有微动脉毛细血管微静脉的微血管系统，而获得稳定的局部血供。
目前认为血管内皮生长因子VEGF是最重要的刺激毛细血管再生的生长因子。但无论是将外源性的VEGF蛋白直接注入骨折区域，还是将含转染VEGF基因的真核表达载体的靶细胞植入骨折区，虽然均可以获得VEGF在骨折区局部作用，但仍存在VEGF的表达量或表达时间的控制的探索问题，此外，实验观察还表明既使骨折区局部有VEGF的稳定存在，也多形成低流量和不稳定的毛细血管，而且这些毛细血管有时产生不同程度的退化，难以进化形成有意义的血管网。此外，VEGF的使用还涉及到几个严重的安全性问题，其中一个潜在的并发症是非缺血靶组织的非特异性新血管化或“附带”新血管化，不可控制的新血管化可能会导致处于静止状态的肿瘤细胞或组织的生长。将骨髓基质干细胞(MSC)体外诱导分化成为血管内皮细胞(EC)或直接体内取材体外培养获得的血管内皮细胞，将该两种细胞直接应用于骨折区促进血管再生，虽然这一思路在实验中显示许多积极意义，但是它目前仅停留在动物实验阶段，主要问题是体外诱导的MSC向EC方向分化的程度难于确定，将其植入动物体内后有去分化现象;而体外培养自体来源的EC，不仅存在操作繁琐，体外培养较难的问题，而且在人类EC标本来源和取材就是一个难于越过的鸿沟。血管新生过程本身受一系列生长因子的调节，且这些生长因子相互协调、相互补充，而单个生长因子并不足以诱导成熟的血管新生。因此人们在探索用基因治疗骨缺损时，力求找到能促进多基因共同表达的因子，以诱导生理功能完整的新血管生成。
关键词：细胞凋亡；白介素1转换酶；蛋白酶
1概述
细胞凋亡是区别于细胞坏死的一种细胞死亡形式，它是在一定的生理和病理条件下，一种并不引起机体炎症反应的细胞程序性死亡（programmedcellDeath，PCD）的过程。细胞凋亡这一概念最早由Kerr等提出的[1]，认为该种细胞死亡像秋天的树叶凋谢一样，故称谓“Apoptosis”，希腊文即凋亡之意。细胞凋亡在形态学和生化改变方面具有特征性。形态学改变包括细胞皱缩，染色质浓缩，核裂解成碎片，最终细胞膜及内质网膜将完整细胞器及碎片包裹成多个分散的凋亡小体。生化改变以往认为内源性核酸内切酶活性增加染色质核小体间DNA断裂是引起凋亡的一个启动因子，但有些具有细胞凋亡特征性改变的却没有染色质核小体间DNA断裂，有的甚至缺乏细胞核[1]，看来仅仅以此酶活性增加作为凋亡的启动因子，不能得到满意的解释。目前许多学者都着重于对细胞内蛋白酶的研究，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。研究依据为：（1）在细胞凋亡早期已发现特异的、可复制的细胞内蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制剂可抑制细胞凋亡的发生[3]。（3）部分病毒蛋白质作用类似蛋白酶抑制剂，可以抑制细胞凋亡[4]。（4）基因删除实验证明某些蛋白酶在细胞凋亡中起着主要作用[5]。
2白介素1转换酶家族（ICE家族）
在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的为白介素1转换酶（Interleukin1convertingenzyme，ICE）是巯基蛋白酶的一种。ICE的作用是将无活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解为有活性的17.5KD的细胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年发现，此酶有高度的底物特异性。ICE高度表达导致细胞死亡，而ICE抑制剂如痘苗病毒CrmA可抑制由各种不同刺激因子诱导的细胞凋亡[7]。在线虫C.elegans的遗传学研究中发现1090个细胞中131个细胞出现了预定的细胞凋亡，调控该程序性死亡的基因已被确认。基因删除实验证明有2个基因ced-3和ced-4是引起细胞凋亡所必需的。尽管由ced-3编码的多肽其功能还不十分清楚，但这一分子显示与人类ICE有广泛的相同部分，ced-3蛋白与ICE有29%氨基酸残基同源性。ced-3蛋白最长的保护顺序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺标记和晶体学研究[8]均发现ICE活性位于半胱氨酸残基，此基团在催化作用中起着关键作用。活性型ICE是一个四聚体，由两个20KD和两个10KD亚基因组成。它是由无活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X连接处降解成20KD和10KD亚基。晶体学研究提示2个亚基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE间29%同源性促使对包括人类的哺乳类细胞凋亡过程中ICE作用的研究，已发现鼠成纤维细胞中ICE过度表达引起细胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基团突变，则导致催化活性和诱导转染细胞凋亡的功能的丧失。由ATP诱导的鼠腹膜巨噬细胞凋亡及亚胺环已酮及肿瘤坏死因子诱导的Hela细胞凋亡过程中均发现有成熟的白介素1释放[9]，提示ICE在细胞凋亡中被激活。目前对于与ICE活性有关的特异性底物还不十分清楚。随着研究的不断深入，ICE家族成员不断扩大，统称为ICE同类物（ICEhomologues）。包括：1）Nedd-2，最初从鼠大脑细胞发育早期一组基因中发现的，后在人胎儿大脑细胞cDNA库中分离得到相同的基因，命名为Ich-1（即ICE和ced-3同类物-1），其编码蛋白顺序与ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有两种不同的mRNA即长Ich-1和短Ich-1。长Ich-1过度表达诱导细胞凋亡。而短Ich-1过度表达抑制细胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32与ced-3同源性为35%，与ICE同源性为30%，其在真核细胞内的表达能诱导细胞凋亡。CPP32又称为YAMA和apopain。CPP32的底物特异性不同于ICE。前者在P1-P4位点偏向性为四肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及长Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦称为ICErelⅡ或Ich-2），与ICE有50%同源性，与ced-3有30%等同性[12]。该酶亦为巯基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前体变为有活性的ICE[12]。TX在哺乳类动物细胞中的过度表达诱导细胞凋亡[12]。TX几乎不降解前白介素1。4）ICErelⅢ与ICE等同性为52%，与ced-3同源性为25%。该酶也不降解前白介素1，但仍使转染的Hela细胞发生凋亡。5）Mch2，是近年来发现的一个ICE家族成员，在氨基酸水平上与ced-3有35%等同性，与ICE有29%的同等性。Mch2不降解含有DEVD或YVAD产荧光的底物。Mch2底物的偏向性可能与CPP32或ICE的偏向性有很大不同。ICE家族偏向性成员的共同特性为：（1）这些蛋白酶参与催化降解作用依赖于P1位点的天冬氨酸，该特性与细胞毒T细胞特异的granzymeB有相同之处，后者为独特的丝氨酸蛋白酶。（2）这些蛋白结构均为多聚体，一般为四聚体，由大为17-22KD，10-12KD的亚单位组成。大小亚单位由单一的转录编码翻译成酶原，然后在各种天冬氨酸-X键处降解为两个亚单位。所有的ICE同类物都是具有相似的催化位点和相似的在等电点及天冬氨酸结合的部位。（3）这些蛋白酶均能自我催化或激活别的ICE同类物。由于在细胞凋亡过程中，ICE同类物并不是唯一的蛋白酶，许多描绘凋亡中蛋白酶的研究都是来源于蛋白酶抑制剂的研究，如TLCK、TPCK、TAME等，这些蛋白酶抑制剂抑制了与凋亡有关的各种细胞系统中DNA的降解[2，3，13]，故它们可能除了直接抑制ICE同类物外，还抑制ICE作用前或ICE作用后的蛋白酶（即非ICE蛋白酶）。
3蛋白酶的底物特异性
近来研究显示在COS细胞内过度表达的ICE、TX和Nedd2可降解PARP[14]，PARP是目前较明确的底物之一。CPP32除了降解PARP外，还降解固醇反应元件结合蛋白SREBP-1和SREBP-2。所有这些发现都提示尽管在ICE家族中成员间有部分功能的重叠，但底物特异性可以有所不同。如体外实验纯化的ICE浓度在降解PARP比降解前白介素1要高出50-100倍。ICE的天然底物是前白介素1，降解产生有活性的白介素1，奇怪的是granzymeA也激活前白介素1[15]。尽管granzymeA降解前白介素1的位点与ICE降解前白介素1的位点不同，但两者激活的白介素1都具有生物学活性[15]，进一步证实了这样一个观点即存在不同种类的蛋白酶，其间有功能上的重叠。目前又发现层粘连蛋白（Laminin），能被称为LamP的假定为ICE同源物蛋白酶降解。层粘连蛋白是较明确的一个底物，由于它的降解作为细胞核凋亡的一个标志，LamP的激活可能是凋亡过程终末阶段的一个关键步骤。由于LamP至今还未被克隆化，到底其是否代表了ICE家族中的一个早已明确的成员？目前还不清楚。
4iCE同类物间的相互作用
与ICE结构最相似的TX/ICErelⅡ和TX/ICErelⅢ（可能还包括其他成员）都不有效地降解前白介素1，这就意味着ICE主要作用是降解前白介素1，其它ICE同类物在过度表达时诱导细胞凋亡，由于这些蛋白酶在细胞凋亡中的作用的证据主要来源于其抑制剂的研究，而这些抑制剂如CrmA和AC-YVAD-CMK等并不具有高度特异性，其在不同程度上抑制所有ICE同类物，故不能区分到底是哪个蛋白酶在调节细胞凋亡中起主导作用。其次，CPP32可能降解PARP，Mch2也降解PARP及降解ICE，TX和Nedd2在足够浓度时也降解PARP，故假定哺乳类动物（包括人类）细胞凋亡途径涉及单一的某种ICE同类物似乎过于简单化，所有这些都提示ICE同类物间是互相作用协同参与细胞凋亡的。
5各种蛋白酶间的作用模式
如上所述，在细胞凋亡过程中涉及各种不同的蛋白酶，那么它们是如何协调的呢？由于大部分蛋白酶的底物还不清楚，部分蛋白酶还没有被确认，因此要设想一个包容所有发现的单一模式似乎不可能。但不管怎样，这些蛋白酶间的相互作用必为以下两种模式的一种或不同阶段以不同模式出现。（1）蛋白酶是同时被激活的，对凋亡信号的反应是彼此独立的，蛋白酶间没有各种级别。（2）有级别的一系列级联和/或连锁反应。到底是何种模式，还有待于进一步研究。
6蛋白酶抑制剂的作用
细胞外蛋白酶活性受内源性蛋白酶抑制剂高度调节，细胞内蛋白酶抑制剂已被发现。尽管后者被认为在调节细胞凋亡中起重要作用，但目前才开始受到重视。病毒serpincrmA的表达显示能抑制由神经生长因子撤除诱导的脊髓背根神经节神经元的凋亡，还能抑制Fas配体和TNF诱导的不同类型的细胞株的凋亡[9，11]。目前还不清楚CrmA的抑制凋亡是由于ICE、CPP32的抑制或其它关键蛋白酶的抑制。近来又发现nexin1（另一种serpin）也可抑制自发的和axotmy诱导的小鸡脊髓运动神经元的凋亡，血浆蛋白溶酶原激活抑制剂2（亦为serpin的一种），也显示抑制TNF诱导的细胞凋亡。有趣的是，最近发现用热诱导的FM3A细胞，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatina测定FM3A细胞的高热反应，结果显示在加热至44℃时出现显著的细胞毒效应，提示蛋白酶抑制剂可能诱导细胞凋亡，该现象与以往认为蛋白酶抑制剂是抑制凋亡的现象不符合。那么就出现这样一个问题：蛋白酶抑制剂是否存在双向调节？在什么情况下可能出现诱导细胞凋亡？
7目前存在的问题
近年报道与细胞凋亡有关的蛋白酶，除了ICE家族外，还包括：（1）fragmentin/granzymes（2）丝氨酸蛋白酶；（3）calpains（4）ubiquitin依赖的蛋白降解作用[17]（5）降解体内巯基蛋白酶如组织蛋白酶D（cathepsind）[18]和组织蛋白酶B（cathepsinB）等。
近来发现组织蛋白酶D（天冬氨酸酶类）能促使干扰素、FAS和TNF诱导的细胞凋亡，且是调控细胞凋亡的一个限速酶。其抑制剂pestatina抑制该系统细胞的死亡[18]。目前我们消化所实验室也正在试图研究在两种不同的组织蛋白酶B表达的胃癌细胞株中的组织蛋白酶B抑制剂在细胞凋亡中的作用（待发表资料）。但是，我们尚缺乏足够的证据表明以上蛋白酶在细胞凋亡过程中涉及的细胞内底物的性质和种类。事实上，在细胞凋亡过程中，绝大多数的细胞内蛋白质并未降解。另一方面即蛋白酶的良好底物使问题更趋复杂化。因此，研究和确认与细胞凋亡相关的蛋白酶的细胞内底物及该底物在细胞凋亡中的作用对于加深我们对细胞凋亡机制的了解具有重要意义。
8细胞凋亡相关蛋白酶研究的临床意义
众多研究表明一种或多种蛋白酶可能在细胞凋亡发生、发展过程中起关键性作用。研究者们已认识到蛋白酶和蛋白酶抑制剂可能为临床治疗某些疾病，延缓或加速细胞凋亡过程提供新的途径，例如可以应用一些蛋白酶抑制剂旨在延缓如缺血-缺氧所诱发的神经元、心肌肾脏上皮细胞的细胞凋亡进程。反之，可应用某些蛋白酶或某些蛋白酶激活剂（也有可能为某些蛋白酶抑制剂）来加速其细胞凋亡进程（如肿瘤等）。值得指出的是目前有关蛋白酶途径在细胞凋亡中治疗应用前景的讨论还仅仅是一种推测，还需要作大量的实验研究才能得到较明确的结论。
其中大致包括以下几个方面：
第一，需了解细胞凋亡相关蛋白酶在细胞内是如何被激活的？激活过程是如何完成的？阐明蛋白酶在细胞内被激活过程及其调控因素对于发现新的临床治疗途径会有帮助。
第二，如上所述，细胞凋亡过程可能会牵涉到多种蛋白酶的协同作用和连锁酶解反应。近来研究表明层粘蛋白酶酶解反应可能继PARP蛋白酶反应之后[19]。假定细胞凋亡涉及到多种蛋白酶的连锁酶反应（瀑布效应），那么发现位于连锁反应之首的蛋白酶将会为临床治疗提供独特的靶目标。
第三，对细胞凋亡相关蛋白酶基因调控机制及细胞内代谢过程目前了解甚少。近年研究表明，表达肿瘤基因bcl-2的细胞其IRP的激活明显减少[20]。实验结果表明bcl-2可能为IRP的抑制剂。
第四，对肿瘤细胞内细胞凋亡相关蛋白酶的表达及其调控目前研究甚少。一方面，bcl-2或其它未知基因产物所诱导的蛋白酶激活抑制与肿瘤细胞不易凋亡有关。另一方面，肿瘤组织内某些蛋白酶基因在的过度表达和调控失常在肿瘤细胞凋亡中所起作用也应值得进一步研究探讨。
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【摘要】我国是世界上急性肝衰竭和终末性肝病发病人数最多的国家。目前，这两种疾病治疗的唯一有效手段是进行肝移植。但肝脏供体紧缺制约了移植手术的发展。组织工程学是解决肝脏生物制造最有效的方法，但是肝组织工程的发展依然需要克服一系列技术挑战，包括种子细胞种类、来源；支架材料性能和结构的要求；组织、器官体外培养和构建等方面等难题。我们相信随着科学技术的不断发展，在不久的将来，通过组织工程方法必将成功构造一个具有各种生理功能的可移植的肝脏。
【关键词】组织工程；肝衰竭；肝脏移植；支架材料；生物反应器；生物人工肝
Abstract：Chinaisthecountrywhichholdthehighestincidencerateofacuteandchronicliverdisease.Livertransplantationistheonlyeffectivewayforthedisease.However，itsclinicaldevelopmentishamperedbytheshortageoforgansupply.Tissueengineeringappearesthemostpromisingtherapyforliverdiseases.However，therearemanytechnicalchallengesincludingthecellsource，nontoxicandbiocompatiblematerialinvitrocultivationoftheconstruct.Withthefastdevelopmentoftechnology，afunctionaltissueengineeredlivercapableoftransplantationwillbeconstructedsuccessfullyinthenearfuture.
Keywords：Tissueengineering；Hepaticfailure；Livertransplantation；Scaffold；Bioreactor；Biologicalartificialliver
1引言
肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能，急、慢性肝脏疾病，尤其是肝功能衰竭严重影响着人们的健康。肝脏移植是从根本上治疗慢性肝病与肝功能衰竭的方法［1］，但受到供体肝脏匮乏、异种移植失败和需要长期使用免疫抑制剂的限制［2］。因此，肝脏疾病治疗急需寻求新的方法，肝脏组织工程为肝病的治疗带来了新的希望。
组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，近年来，随着生命科学、材料科学和工程科学的发展，科研人员相继在多种组织、器官体外再造的研究方面取得突破性进展，其中，一些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化［3-4］。肝脏组织工程是组织工程研究领域中的重要研究方向之一，其目标是构建一个可供移植的肝脏组织或类器官，从而对肝功能受损的患者进行治疗。现今，科学家已模拟体内自然肝脏，成功构建出具有一定功能和活力的组织工程化人造肝脏系统。然而，由于肝脏组织结构和生理功能的复杂性，构建一个具有功能和可移植的组织工程化肝脏的工作仍面临极为严峻的挑战。
总结过去二十年组织工程研究的经验和教训，越来越多的研究人员意识到，组织工程研究应充分考虑各方面因素，拓宽现有的研究手段和思路［5］。近年来，随着各学科的创新与发展，肝脏组织工程研究取得了丰硕的成果，相信随着人们对肝脏体内外构建研究的深入，组织工程化肝脏构建研究有望取得实质性突破。
2种子细胞种类、来源
在肝组织工程研究中，种子细胞的选择非常重要，已研究的有下列几种细胞，例如骨髓源干细胞，肝卵圆祖细胞，成熟肝细胞，肝细胞株［2，6-7］。选择哪一种细胞要根据需要以及期望这种细胞所展现出来的肝细胞特性而定。
2.1骨髓源干细胞
骨髓源干细胞具有多向分化的特性，且来源于自体，可避免排斥反应，这些特性和优点使其成为最有潜力的种子细胞来源。但是我们对其定向诱导为肝细胞的机制并不完全了解［2，8-10］。关于诱导机制中生长因子，细胞信号在细胞外基质传导，特殊的细胞信号通路正在研究中。
2.2肝卵圆祖细胞
肝卵圆祖细胞在肝脏中与临近的肝细胞和分化终末期的胆管形成细胞紧密相连，是一种过渡的胆管细胞。这种细胞不一定分化为成熟肝细胞，在分化为特定的细胞系之前具有多种分化选择［8-9］。例如：可以通过不同的细胞信号分化为肝脏中其他功能细胞。若能设法为卵圆细胞创造理想的条件，使之能朝我们需要的细胞系方向分化，其应用前景很乐观。
2.3成熟肝细胞
成熟肝细胞可以通过完整或切除的部分肝脏灌注来获得，但细胞在体外培养后不完全具有和体内肝细胞相同的表型和功能，原因是体外培养环境不能完全模拟体内的生长环境，同时也缺少其它细胞类型信号的影响。许多研究者为提高体外培养的肝细胞活性和功能状态做了大量的工作，主要集中在两方面：一是利用肝细胞的细胞外基质成分和肝细胞的极性使肝细胞集落生长并增强集落内部的营养和氧气供应；二是将肝细胞和其它非肝实质细胞共培养。但由于是终末性细胞，很难传代培养，而且原代肝细胞多取之于鼠和猪之类的动物，不易直接用于体内。
2.4肝细胞株
目前，肝细胞株主要是指肿瘤来源的细胞株。这些细胞株包括HepG2/C3A或SV40Tag，能大量长期培养，增殖能力强，而且具有一定肝细胞的功能水平如白蛋白合成和细胞色素P450活性等，是目前最有希望应用于人工肝临床实验研究的一类细胞［2，7，10］。但是，这些细胞源于肿瘤，临床应用时，必须考虑有可能引发肿瘤发生的风险。
3肝组织工程中的支架材料
支架材料是组织工程研究中的一部分，其作用在于为细胞的贴附提供空间支持，增加细胞粘附表面积，支持较大的细胞团块生长发育［11-12］。目前肝组织工程支架材料的研究还处于筛选阶段。主要是在现有结构性组织工程中表现较好的可降解高分子材料和天然基质材料中选用，如PLGA、海藻酸钠、壳聚糖、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等。
3.1肝组织工程生物材料的修饰与改性
纵观目前国内外医用生物材料的研究，不难发现适合肝组织工程支架的材料寥寥无几。天然高分子材料具有生物可降解性，良好的力学性能以及可调节的降解速度，然而，这些材料的细胞相容性不够理想。天然基质材料虽然生物相容性较好，但力学性能差，一般难以满足组织工程材料支架对力学强度的要求。如果能利用修饰或者改性的方法，使天然高分子材料和人工高分子聚合物扬长避短，则有可能制造出一类兼有良好的力学性能和细胞相容性的生物材料，更好的使细胞贴附，生长和行使功能。近年来，这一研究方向引起了人们极大的兴趣。特别是把一些特异的生物活性分子固定在框架材料上具有极其重要的意义。对框架进行这样的表面修饰之后，原理上可以引起植入细胞产生某些特殊的反应，而这些反应又是人们可预见和可控制的。这些修饰可为种植于其上的细胞提供了合适的环境因素，这些经过多因素修饰后并能活化细胞功能的多聚物被认为是生物活性材料。
3.2植入材料体内组织相容性判断
材料植入动物体内后，为评价材料植入后与组织之间的相互作用，需要建立一套评价方法：比如用全自动生化分析仪动态监测植入后动物血清中肝功多项指标如解毒功能、分泌功能（白蛋白、胆红素）和相关酶类的变化情况；同时必须考虑体内的免疫反应。由于实验动物多使用同种异体细胞，而植入体是材料与细胞的复合物。因此，要同时考虑机体对异体细胞和生物材料的不同反应。组织工程肝脏植入体内后，需要检测体内是否发生免疫反应以及免疫反应的轻重，探索免疫反应发生的机理，为最终减轻甚至排除免疫反应提供支持。
4组织和器官体外培养和构建
4.1生物反应器
生物反应器是一个封闭系统，由接种肝细胞后的多聚材料形成包囊，管接循环介质，培养液贮存器，捕捉气泡的除泡器，以及可以氧化培养液的增氧器组成［13］。
研究证明形成包囊的多聚材料可以促进细胞贴附，并且其多孔性有利于细胞接触以及营养交换，能为细胞贴附生长提供更广阔的空间。培养液循环系统可以增加细胞团中心细胞摄入营养和氧气，帮助其排除代谢废物和二氧化碳，明显降低细胞团中心细胞的死亡率。
基于以上优点，肝细胞可以在生物反应器中长期存活，并保持细胞色素p-450和肝脏产物如白蛋白分泌的功能。更重要的是通过在生物反应器的培养，可以对组织工程肝脏未来应用所需的体内外特殊参数检测提供了前景［13-15］。
4.2生物人工肝
生物人工肝(biologicalartificialliver，BAL)是将肝细胞培养在体外生物反应器中，当患者血液流过反应器时，通过半透膜或直接接触的方式与培养的肝细胞进行物质交换，使其中的肝细胞发挥解毒、合成、生物转化等功能，从而达到支持和治疗目的。
1963年Nose教授等在成功通过血液透析系统治疗肾功能衰竭50年后，首次报道一种替代肝脏合成和代谢功能的装置，这是生物人工肝早期雏型。1986年Demetrion教授提出生物人工肝的概念，即由肝细胞和人工解毒装置共同组成的循环系统，能发挥肝细胞的作用［16］。
此后，匹兹堡大学与McGowan研究所设计了生物人工肝反应支持系统（BLSS），使患者血液可以通过生物人工肝的循环取得物质交换和毒素的弥散，但交换过程中纤维膜阻止患者的血液直接接触猪肝细胞，有效地防止了异种病毒感染，保护了患者的健康［17-19］。
BAL在临床实验方面证明，它可以临时代替自然肝脏的部分功能。但还有许多需要克服的困难，毕竟一个可植入性的功能性的肝脏对患者进行长期的功能支持才是我们所希望的最好的选择［20］。
5结论与展望
肝组织工程是一个多学科交叉领域，它是生物学、材料科学、信息科学、制造科学和临床医学等一系列相关学科的发展和技术的创新与集成。现今，肝组织工程研究尚处于起步阶段，还存在许多问题，如选择异种肝细胞将面临免疫排斥和异种病毒感染；生物反应器中细胞培养的血管化；人工肝的功能表达要求各种功能细胞共培养和各类生长因子协调作用等问题亟待解决。但是，肝组织工程的研究成果已十分显著。随着肝组织工程取得每一个新的进展，我们就向获得可植入的人造肝脏前进了一步。虽然构建出可植入的完整肝脏现阶段还不现实，但我们相信不远的将来此研究成果必将造福人类。
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什么是药源性粒细胞减少症
临床资料显示，药源性血液病约占药物不良反应的10％，药物相关死亡病例的40％；在药源性血液病中，粒细胞减少与缺乏占40％左右。白细胞减少症是指血液中白细胞数持续低于4×10／升。由于白细胞的成分以中性粒细胞为主，当白细胞中中性粒细胞计数降低时，称为粒细胞减少症；若白细胞总数低于2×10／升，中性粒细胞绝对值低于0.5×10／升甚至消失，称为粒细胞缺乏症。此时，细菌可能在机体完全或基本丧失抵抗的状态下迅速扩散，甚至引发脓毒血症而导致死亡。本例患者能幸免遇难，得益于早诊断早治疗。
白细胞为什么会减少
引起粒细胞缺乏症的主要有化学物品、药物、感染、物理、疾病和遗传因素。其中化学物品及药物、感染，是引起白细胞减少和粒细胞缺乏症的主要原因。本例患者以感冒起病，感冒多系病毒感染，白细胞往往不高；加之擅自服用对乙酰氨基酚、复方氨酚烷胺胶囊和清开灵等药物，是粒细胞减少的主要原因。
对乙酰氨基酚即扑热息痛，为非处方药，临床使用极广，其常用剂量安全可靠。然而，随着其广泛应用，过量或中毒情况也不断发生，英国许多医院发现该药是导致急性肝衰竭的主要原因。长期或一次大量用药可致肝、肾功能异常，偶见粒细胞减少症。复方氨酚烷胺胶囊每粒含对乙酰氨基酚250毫克，两者合用，对乙酰氨基酚必定超量。
清开灵主要成分为牛黄、水牛角、金银花、黄芩、栀子等的提取物，具有清热解毒、化痰通络、抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用，亦有出现白细胞减少的报道。氨苄青霉素等抗生素也是引起白细胞减少的原因之一。
综上所述，引起本患者粒细胞减少症的因素是多方面的，但超量应用对乙酰氨基酚应是主要的罪愧祸首。
如何避免感冒药致粒细胞减少症
秋冬季节，感冒多发，合理应用抗感冒药，是避免致粒细胞减少症的关键。
1普通感冒和流感都是由病毒引起，抗生素对病毒无效。如果症状不严重，即使不服药，一般5-7天也可痊愈。盲目用药弊多利少。
的改变而引起的变异（2）种类：①缺失：染色体缺失引起的变异②重复：染色体中
某一片段引起的变异③易位：染色体的某一片段移接到另一条
上引起的变异④倒位：染色体中某一片段
引起的变异（3）结果：使排列在染色体上的基因或发生改变，从而导致性状的变异（4）举例：猫叫综合征，是由于人的第5号染色体部分引起的遗传病.2.染色体数目的变异（1）概念：由
而引起的变异（2）类型：①细胞内
的增加或减少②细胞内的染色体数目以
的形式成倍增加或减少.（3）结果：使基因的数量增加或减少（4）举例：三倍体无子西瓜等.3.与染色体数目变异有关的概念（1）染色体组：细胞中的一组染色体，它们在和上各不相同，携带着控制生物生长发育的全部遗传信息.（2）二倍体：由发育而成，体细胞中含有染色体组，包括几乎全部动物和过半数的高等植物.（3）多倍体：①概念：由发育而来，体细胞中含或染色体组的个体.其中，体细胞中含有三个染色体组的叫做，含有四个染色体组的叫做.例如，
是三倍体，
是四倍体.②分布：在
中常见，在
中极少见.③特点：与二倍体植株相比，多倍体植株常常是茎秆
，叶片、果实和种子都
，
等营养物质含量丰富.（4）单倍体：①概念：由
发育而来，染色体数和染色体组数是正常体细胞的一半，即体细胞中含有染色体数目的个体.②特点：与正常植株相比，植株长得
，且.4.低温诱导植物染色体数目变化的实验（1）实验原理：低温抑制
的形成，以致影响
被拉向两极，细胞不能分裂成两个子细胞，于是染色体数目改变.（2）方法步骤：洋葱根尖培养固定制作装片（解离
制片）观察.（3）试剂及用途：①卡诺氏液：②改良苯酚品红染液：③解离液[15%的盐酸和95%的酒精混合液（1∶1）]：[预习反馈]1.发生在两条同源染色体之间和非同源染色体之间的互换产生的变异类型相同吗？2.人工诱导多倍体目前最常用而且最有效的方法是什么？无子西瓜和无子番茄哪一种变异可以遗传？3.秋水仙素作为一种植物碱可以诱发基因突变和染色体变异，它分别作用在细胞分裂的什么时期？4.原核生物中可遗传变异的来源是什么？二、重难点整合1.三种可遗传变异的比较基因重组基因突变染色体变异概念因基因的重新组合而发生的变异基因结构的改变，包括DNA碱基对的增添、缺失和替换染色体结构或数目变化而引起的变异类型①非同源染色体的非等位基因自由组合②同源染色体上的非姐妹染色单体之间交叉互换①自然状态下发生的-自然突变②人为条件下发生的-诱发突变①染色体结构变异②染色体数目变异适用范围真核生物进行有性生殖产生配子时在核遗传中发生任何生物均可发生（包括原核、真核生物及非细胞结构的生物）真核生物核遗传中发生产生结果只改变基因型，未改变基因的结构，既无“质”的变化，也无“量”的变化产生新的基因，发生基因“种类”的改变或“质”的改变，但量未变可引起基因“数量”上的变化意义形成多样性的重要原因，对生物进化有十分重要的意义生物变异的根本来源，提供生物进化的原始材料对生物进化有一定意义育种应用杂交育种诱变育种单倍体、多倍体育种思考1基因突变和染色体变异哪一种可以用显微镜直接观察到？2.染色体组和染色体组数目的判断（1）一个染色体组中所含染色体的特点①不含同源染色体②染色体形态大小和功能各不相同③含有控制一种生物性状的一整套基因，但不能重复（2）确定某生物体细胞中染色体组数目的方法①细胞内形态相同的染色体有几条，含有几个染色体组.如图1细胞中相同的染色体有4条，此细胞中有4个染色体组.②根据基因型来判断.在细胞或生物体的基因型中，控制同一相对性状的基因出现几次，则有几个染色体组，如基因型为AaaBBb的细胞或生物体含有3个染色体组.也可以记作：同一个字母不分大小，重复出现几次，就是几个染色体组.控制同一相对性状的基因位于同源染色体上，所以有几个等位基因就意味着有几条同源染色体.③根据染色体的数目和染色体的形态数来推算.染色体组的数目=染色体数/染色体形态数.例如，果蝇体细胞中有8条染色体，分为4种形态，则染色体组的数目为2个.思考2染色体组与基因组有没有区别？3.二倍体、多倍体与单倍体（1）二倍体、多倍体与单倍体的比较二倍体多倍体单倍体概念体细胞中含2个染色体组的个体体细胞中含3个或3个以上染色体组的个体体细胞中含本物种配子染色体数的个体染色体组2个3个或者3个以上1至多个发育起点受精卵受精卵配子自然成因正常有性生殖未减数的配子受精；合子染色体数目加倍单性生殖（孤雌生殖或孤雄生殖）植物特点正常果实、种子较大，生长发育延迟，结实率低植株弱小，高度不育举例几乎全部动物，过半数植物香蕉、普通小麦玉米、小麦的单倍体（2）二倍体、多倍体与单倍体的判断单倍体与二倍体、多倍体是两个概念系统，主要区别在于是由什么发育而来，由合子（受精卵）发育而来的个体，细胞中含有几个染色体组，就叫几倍体；而由配子直接发育而来的，不管含有几个染色体组，都只能叫单倍体，单倍体的概念与染色体组无关.思考3一倍体与单倍体有什么区别？思考4如果是四倍体、六倍体物种形成的单倍体，其体细胞中就含有两个或三个染色体组，我们可以称它为二倍体或三倍体吗？思考5若要研究AaBb杂合子中基因的性质及作用，可用其单倍体为材料有什么优点？4.三倍体无子西瓜的培育过程图示思考6第一年结的西瓜是几倍体？里面的种子是几倍体？思考7第二年结的西瓜是几倍体？有没有种子？思考8第二年提供二倍体普通西瓜的花粉作用是什么？5.单倍体育种与多倍体育种的比较单倍体育种多倍体育种原理染色体数目以染色体组数目成倍减少，然后再加倍从而获得纯种染色体数目以染色体组形式成倍增加方法花药离体培养获得单倍体，再用秋水仙素处理幼苗秋水仙素处理正在萌发的种子或幼苗优点明显缩短育种年限器官大，营养成分含量高，产量增加缺点技术复杂，需要与杂交育种配合适用于植物，动物难以展开.多倍体植物生长周期延长，结实率降低三、典型例题例1（单选）在细胞分裂过程中出现了甲、乙2种变异，图2甲中英文字母表示染色体片段.下列有关叙述正确的是①甲图中发生了染色体结构变异，增加了生物变异的多样性②乙图中出现的这种变异属于染色体变异③甲、乙两图中的变化只会出现在有丝分裂中④甲、乙两图中的变异类型都可以用显微镜观察检验A.①②③B.②③④C.①②④D.①③④解析甲图中发生了染色体结构变异，即倒位，增加了生物变异的多样性；乙图中发生的是着丝点分裂时，两条姐妹染色单体移向了一极，属于染色体数目变异中的个别染色体数目的变异；只要有染色体的生物，细胞分裂（有丝分裂和减数分裂）过程中就可能发生染色体变异；染色体变异可以用显微镜观察.故选C.例2图3为普通小麦的形成过程示意图.请根据图示材料分析并回答以下问题：（1）二倍体的一粒小麦和二倍体的山羊草杂交产生甲.甲的体细胞中含有
个染色体组.由于甲的体细胞中无
，所以甲不育.（2）自然界中不育的甲成为可育的丙的原因可能是
.（3）从图示过程看，自然界形成普通小麦的遗传学原理主要是
.解析普通小麦的形成过程是：一粒小麦与一种山羊草杂交，形成的下一代是异源二倍体，是不育的，但由于低温等自然恶劣条件的影响，一些植株染色体加倍了，形成了四倍体的小麦，也就可育了，也就是二粒小麦；二粒小麦与另一种山羊草杂交，下一代是三倍体，也是不育的，但由于低温等自然恶劣条件的影响，染色体加倍了，就形成了6个染色体组的小麦，也就是今天的普通小麦.答案：（1）2同源染色体（2）低温等自然恶劣条件的影响使细胞内染色体数目加倍（3）染色体变异四、课堂练习1.下列各细胞中，只含有1个染色体组的是（）.A.果蝇的体细胞
B.人的卵细胞C.单倍体普通小麦的体细胞
D.普通小麦的体细胞2.下列有关单倍体的叙述中正确的是（）.A.未经受精的卵细胞发育成的植物个体一定是单倍体B.含有两个染色体组的生物体，一定不是单倍体C.单倍体一定含有一个染色体组D.含有奇数染色体组的个体一定是单倍体3.马的体细胞中有两个染色体组，染色体数目为64条；驴的体细胞中也有两个染色体组，染色体数目为62条.马与驴杂交所生的后代"骡"体细胞中染色体组数和染色体数目分别是（）.A.两个染色体组、63条染色体
B.四个染色体组、63条染色体C.两个染色体组、64条染色体
D.四个染色体组、64条染色体4.把成年三倍体鲫鱼的肾脏细胞核移植到二倍体鲤鱼的去核卵细胞中，培育出了克隆鱼.该克隆鱼是（）.A.是二倍体鱼
B.是有性生殖的产物C.高度不育
D.性状与三倍体鲫鱼完全相同5.在培育三倍体无子西瓜过程中，收获三倍体种子是在（）.A.第一年、二倍体母本上
B.第一年、四倍体母本上C.第二年、三倍体母本上
D.第二年、二倍体母本上6.在农业生产上常用人工诱导多倍体育种的方法来提高农作物产量，在下列四组农作物中采用多倍体育种最有经济价值的是（）.A.玉米和高粱
B.水稻和棉花
