关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法
中图分类号X172文献标识码A文章编号1007-7731（2017）13-0036-03
StudyonSoilMicrobialDiversityinHeavyMetalContaminatedSoil
LiYan1etal.
（1AnhuiHuajingResourcesandEnvironmentTechnologyCo.，Ltd.，Hefei230094，China）
Abstract：Inthispaper，theresearchmethodsofmicrobialdiversityofheavymetalcontaminatedsoilsinrecentyearsaresummarized，andtheiradvantagesanddisadvantagesandtheirapplicationareanalyzed.Theresearchmethodsofmicrobesarealsodiscussed.
Keywords：Heavymetalpollution；Soilmicrobes；Microbialdiversity；Researchmethods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1土壤微生物研究方法
1.1传统的分离纯培养和稀释平板计数在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2Biolog微平板法Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3磷酸脂肪酸分析法（PLFA）磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5高通量测序技术高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6基因芯片技术（GeoChip）基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试验材料
煎饼发酵糊采自本溪寨香生态农业有限公司煎饼生产车间的以大米、大豆、玉米、小米为原料的杂粮发酵煎饼。分离纯化培养基：YPD培养基(酵母浸出粉-蛋白胨-葡萄糖-琼脂培养基)、麦芽糖培养基、玉米粉琼脂培养基、PDA培养基。理化鉴定培养基：糖发酵培养基、碳源同化培养基、氮源同化培养基、无维生素培养基、产类淀粉培养基、高葡萄糖培养基、尿素分解培养基。
1.1.2试验仪器
HG303-恒温培养箱、Gl01-1A型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂；立式高压蒸气灭菌锅；数显恒温水浴箱：北京市光明医疗仪器厂；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；OLYMPUS显微镜；DL-CJ2v单面净化工作台；720型分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。
1.2试验方法
1.2.1酵母采集和扩大培养
将无菌操作采集的样品ZX-2010，浸入灭好菌的YPD液体培养基中，于25℃进行72h扩大培养[7]。
1.2.2酵母菌分离纯化
利用梯度划线法在YPD固体培养基上进行划线分离，分离纯化3代。再改用稀释梯度分离法，用0.9g/100mL生理盐水进行稀释，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个梯度，然后在YPD平板上用玻璃推子将菌液推平，每种涂3个平板，28℃培养72h。从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离，28℃培养72h，镜检后，挑取形态不同的单菌落转接5次，所得菌种接于斜面试管培养基于4℃冰箱保藏。
1.2.3酵母菌形态学观察
采用美兰染色法，观察菌落大小，菌落质地、菌落颜色、菌落表面特征、菌落边缘、隆起度等特征[8]；子囊孢子形态观察[9]、掷孢子的形成观察、假菌丝的观察、无丝状营养细胞的显微镜观察[8]。
1.2.4碳源同化试验
液体试管法：每管加无碳基础培养基5mL，加被测试的碳源(蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、甘油、柠檬酸、乳酸、肌醇、海藻糖)。接入新鲜菌液1mL，25℃培养1周后，观察。
1.2.5氮源同化试验
将测试酵母进行饥饿培养，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。将活化好的菌株接种在无菌碳基础培养基上，加入被测氮源(亚硝酸钠、硝酸钾、赖氨酸)，25℃培养5d。
1.2.6糖发酵试验
将葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、纤维二糖等6种糖，分别用酵母发酵，25℃培养2周，观测其发酵结果。
1.2.7其他生理生化试验
无维生素培养试验，高糖培养试验，产类淀粉试验，尿素分解试验[8]。
1.2.8酵母菌耐酸能力测定
将YPD液体培养基调节pH值为3、4、5、6、7分别接种分离酵母菌，28℃培养72h，以未接种的各酸度培养基作空白，于波长560nm处测定A值[10]。
1.2.9酵母菌糖化能力的测定
将分离到的菌株，分别制成质量分数为5%的酵母浸出溶液后，用DNS法测糖化酶活力[11]。分别取1mg/mL葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8mL加入DNS试剂2mL，沸水浴加热2min，冷却，在540nm波长下测定吸光度A值，制成葡萄糖标准曲线。用1%淀粉液、缓冲液、蒸馏水、酵母浸出液稀释后加入DNS试剂混合，沸水加热2min，在540nm波长下测定吸光度A值。从标准曲线查出葡萄糖浓度数，求出糖含量。
2结果与讨论
2.1结果
2.1.1菌株的形态学鉴定
煎饼糊经过自然发酵，采用YPD培养基从样品中共分离纯化出5种优势酵母菌株，分别标记为1#、2#、3#、4#、5#，观察分离菌株的菌落及菌体形态特征，结果见表1。酵母菌的菌落形态均为圆形，表面大多光滑湿润有光泽、边缘整齐、菌落均呈乳白色、不透明，菌体多为圆形或椭圆形。各菌株均有芽殖现象，且均有假菌丝，均不产生掷孢子。
2.1.2酵母菌的生理生化鉴定
样本ZX-2010分离纯化菌株的糖发酵试验见表2，碳源同化试验见表3，氮源同化试验见表4，其他生理生化试验见表5。其中3#、5#半乳糖同化阳性、硝酸盐同化反应阴性、无维生素不生长、不分解尿素等特征符合假丝酵母属的特征；1#号赖氨酸同化阴性、硝酸盐同化反应阴性、尿素水解阴性等特征符合酿酒酵母特征；2#葡萄糖发酵阴性、淀粉生长阳性符合褶皱酵母特征；4#无维生素生长阴性符合发酵毕赤酵母特征；3#淀粉生长阳性、0.01%放射菌酮生长阳性等符合热带假丝酵母特征。根据上述菌落和菌体的形态学鉴定以及生理生化试验结果，对照《酵母菌的特征与鉴定手册》[8]对酵母菌进行鉴定，结果为1#菌为酿酒酵母，2#菌为褶皱假丝酵母，3#菌为热带假丝酵母，4#菌为发酵毕赤氏酵母，5#菌为滑假丝酵母。
2.1.3酵母菌耐酸能力的测定
在煎饼发酵过程中，酵母菌往往需要耐受杂菌所造成的酸性环境，通常发酵煎饼糊的最终pH值可降到4。因此试验测定酵母菌在不同pH值下生长情况，可以更好地了解其对酸性环境的耐受能力结果见图1。如图1可见，酵母菌在pH值为3时均不生长，最适条件都在pH值为5~6。其中1#、2#、3#菌株长势较好，而其他菌株都受到不同程度的影响。因此选择1#、2#、3#适合作为发酵煎饼发酵菌。2.1.4酵母菌糖化活力的测定煎饼经发酵后产生的糖的含量直接影响煎饼的风味和口感，因此酵母菌的糖化能力是鉴定酵母菌株的重要指标，酵母菌糖化所得到的葡萄糖含量见表6。如表6所示，1#、2#、4#产糖量分别为0.854、0.639、0.716mg/mL，产糖能力明显高于其他菌株。
2.2讨论
自然发酵属于多菌种混合发酵，含有多种酵母菌，发酵过程中多种微生物共同作用产生丰富的风味物质[12]。发酵煎饼中的主要微生物所产生的代谢产物具有类脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶活性。酵母菌的脂肪酶和蛋白酶能分解原料中的脂肪和蛋白质，有利于煎饼摊制成型的形成。其中酿酒酵母的数量最多，酿酒酵母也广泛存在于传统发酵食品中[13-14]，如面包、香肠等面食及肉食品中，酵母菌有利于改善谷物发酵制品的风味和口感，去除发酵制品的不良风味，而且能改善产品的风味和延长保质期。发酵煎饼中的酵母菌也有类似的作用，酵母菌等含有丰富的α-淀粉酶和糖化酶，发酵过程中酵母菌产生的酶将淀粉分解成各种糖类物质，发酵过程降解淀粉产生醇、酸、酯、醛、酮等多种风味物质[15-16]，使发酵煎饼经摊制后有自然的发酵香味，同时发酵过程产生的淀粉酶使一部分淀粉分解成葡萄糖，在煎饼摊制过程中与蛋白质发生美拉德反应也使煎饼的色泽更加诱人。这就是发酵煎饼品质优于不发酵煎饼的原因之一。
酵母菌除了对风味有明显的影响外，在加工性质及保藏品质方面也有积极的影响[17]。发酵过程可以一定程度上降低煎饼糊的黏度，使其在加工时减少搅拌阻力，有利于煎饼摊制成型。淀粉经过发酵，一部分淀粉粒分解成小分子的多糖和单糖，降低了淀粉的糊化温度[18]，在煎饼摊制的过程中减少加热时间。在保藏中可延长产品保质期，延缓产品老化。通过对分离结果分析表明，煎饼自然发酵糊中的主要微生物为酵母菌，因此发酵温度保持在28~30℃，酵母菌的生长最旺盛，发酵效果最好，也能有效地控制杂菌的生长，防止发酵煎饼糊酸度过大抑制酵母菌的生长，从而减少杂菌对煎饼的风味和口感的影响[19]。
【关键词】红曲菌；分离；纯化；鉴定
Abstract：［Objective］Toisolate，purifyandidentifyMonascusstrainsfromredfuru.［Method］BasedoneosinophilicandethanoltolerantcharacteristicsofMonascus，stainswereisolatedfromredfurubyculturingonmaltjuicemediumcontainingalcoholandricemediumcontaininglacticacid.Strainswerepurifiedusinglogarithmicplatedilutionmethod，andthendeterminedgeneraaccordingtotheirmicro-morphologicalcharacteristics.Byculturingonmaltextractagarmediumwithtemperatureof25degreesCelsius，strainswereidentifiedtospeciesbasedonthemorphologicalcharacteristicsofcolonies.［Result］M-1strainisolatedfromredfuruwasidentifiedasMonascuspilosusandM-2Monascusanka.［Conclusion］StrainsisolatedfromredfurnareMonascusfungi.
Keywords：Monascus；isolation；purification；identification
红曲菌隶属真菌界（Eumycophyta）子囊菌门（Ascomycota）真子囊菌纲（Euascomycetes）散子囊菌目（Eurotiales）红曲菌科（Monascaceae）红曲属（Monascus）［1］，具有防腐，解毒；消食活血、健脾燥胃之功效［2］。我们根据红曲菌嗜酸、耐乙醇的生长特性［1］，对市售红腐乳中的红曲菌进行分离纯化，并对它们进行了形态学鉴定，为进一步发掘红曲菌生物资源做了有益探索。
1材料和方法
1.1实验材料
(1)原料：市售红腐乳、大米、琼脂粉、乙醇、乳酸，麦芽浸出粉（maltextract）。(2)麦芽汁：麦芽浸出粉3g，蒸馏水100ml，PH3.54.0，分装5ml/管，每管加95%乙醇2滴。(3)大米培养基大米10g，蒸馏水15ml，1%乳酸40ul。(4)麦芽汁培养基麦芽浸出粉6g，琼脂粉4g，蒸馏水200ml，PH5.0～6.0。(5)麦芽提取物琼脂（maltextractagar，MEA）培养基麦芽浸出粉2g，蛋白胨0.1g，葡萄糖2g，琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，PH6.0。
1.2方法
1.2.1分离
无菌条件下，红腐乳汁经2层纱布过滤，取0.1ml滤液于5ml麦芽汁，一式3管，空白对照1管。32℃培养，观察。挑取麦芽汁上长出的红色菌体少许，置于大米培养基中，一式3皿，空白对照1皿。32℃培养，观察。
1.2.2纯化
从大米培养基上挑取红色菌体少许于1ml无菌生理盐水（NS）中，用对数稀释平板法［3，4］获得纯培养。
1.2.3鉴定
取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基32℃培养成熟。在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用解剖针挑取少许菌丝，用50％乙醇浸润，再用蒸馏水清洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来，盖上盖玻片(勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片)，制成水浸标本片，用显微镜观察。取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基25℃培养，观察红曲菌落大小、形态、色泽，气生菌丝的产生情况。
2结果
2.1分离
接种红腐乳汁的麦芽汁在3～4d后可见白色团状菌丝，7d后菌丝转为红色，培养液亦呈红色，而CK管中始终无菌体生长。3d后，接种分离菌的大米培养基上有微量无色菌体生长，6d后菌落明显，呈白色，7d后菌落长大，粉红色，8d后菌落更大，红色。
2.2纯化
将来自大米培养基的真菌稀释液涂布于麦芽汁平板培养后发现菌体生长良好、无杂菌，并出现明显的单菌落，编号为M-1～M-3……。
2.3形态学鉴定
显微镜观察所分离的菌丝具不规则分枝，多核，有横隔，含油滴，透亮或有深浅不一的红、褐色色素，分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，孢子单生或链状，闭囊壳球形，有柄（图1）。
纯化后的M-1菌株点种到MEA培养基，25℃培养，初期为圆形白色小菌落，7d后菌落圆形，直径28mm，米色，气生菌丝丛毛状，菌落背面红色，有放射状条纹（图2）。
纯化后的M-3菌株接种到MEA培养基，25℃培养，菌落初期为圆形，白色，7d后菌落直径8mm，铁锈色，中间裂开，边缘较整齐，质地致密；25d后，菌落直径22mm，深锈色，中间隆起，裂开，边缘有缺刻，无气生菌丝，菌落背面深赭色，有放射状条纹（图2）。
3结论
红腐乳汁接种到含乙醇的麦芽汁中长出的菌产红色色素、菌丝致密、成团生长，初步判断为红曲菌，再用含乳酸的大米培养基筛选祛除杂菌。这与红曲菌的生态习性有关，同时也证实了在PH2.5和高达10%乙醇的培养条件下一般只有红曲菌才能生长。将分离菌株的显微形态特征与红曲菌(Monascus)的属征［1］相对比，两者基本吻合，进一步证实我们所分离的纯培养M-1、M-3确为红曲属真菌。将纯化后的分离菌株点种到MEA培养基，25℃培养，观察其菌落生长形态特征，对照李钟庆等的红曲菌属分类检索表［1］，将M-1菌株鉴定为丛毛红曲菌（Monascus.pilosus），M-3菌株鉴定为红曲红曲菌（Monascus.anka）。这不仅丰富了红曲菌种库，而且为进一步发掘红曲菌生物资源奠定基础。
参考文献
［1］李钟庆，郭芳.红曲菌的形态与分类学［M］.北京：中国轻工业出版社，2003：2，11，3-6，45-48.
［2］李时珍.本草纲目［M］.重庆：重庆出版社，20006：390.
