基因重组(6篇)

基因重组篇1

【摘要】目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。

【关键词】NOX4;报告基因;表达调控

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)，成为机体抵抗微生物感染的重要成分[1]。近年，在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPHoxidase)蛋白家族。人类基因组同源性检索发现了7种NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[2-4]。。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用，我们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3NOX4，并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。

1主要材料和试剂

A549上皮细胞株、E.coliDH5α为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK及DualLuciferaseReportAssaySystem为Promega产品。质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子TNFα、IFNγ购自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP，限制性内切酶(Xho1，BamHⅠ)，T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒，DL2000DNAMarker购自天根生物技术有限公司。

2方法

2.1质粒载体的构建

2.1.1引物合成通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有NFκB结合位点的NOX4基因上游调控序列。引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下：

P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAG

P2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA

引物分别含限制性内切酶Xho1，BamHⅠ酶切位点，扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。

2.1.2PCR以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25μL，含10×PCR反应buffer2.5μL;dNTP2μL;上下游引物各0.5μL;Pfu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水补足。反应条件为94℃变性3min，之后进行30个循环(94℃30s，.51℃30s，72℃4min，，)，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。pGL3basic载体用Xho1，BamHⅠ双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。

2.1.3重组质粒的构建经酶切纯化后的PCR产物和pGL3basic载体用T4DNA连接酶连接，转化到E.coliDH5α感受态细菌中，涂布于LB培养板，37℃孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamHⅠ进行双酶切鉴定，最后经ABI3730全自动DNA测序仪进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。

2.2细胞转染及报告基因活性检测

2.2.1细胞转染用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10×104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95%时，按照Lipofectamine2000说明书进行重组质粒pGL3basicNOX4和pRLTK载体转染。具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM(100μL/孔)，Lipofectamine2000与质粒DNA(报告基因重组质粒和内对照质粒pRLTK)以一定比例各加入100μL无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，再加入细胞培养孔，37℃，5%CO2的孵箱中培养24-48h。

2.2.2细胞因子刺激试验实验分组为TNFα组，IFNγ组，TNFα+IFNγ组，空白对照组。TNFα终浓度为25ng·mL-1，IFNγ终浓度为10ng·mL-1，在细胞因子刺激A549细胞的不同时间点(6h，12h，24h)，裂解细胞检测NOX4报告基因表达水平。实验均设3复孔。

2.2.3报告基因活性检测在细胞因子刺激细胞后的不时间点吸去培养基，PBS洗涤细胞。每孔加入60μL的1×PLB细胞裂解液(按DualLuciferaseReportAssaySystem试剂盒说明配备)，孵育30min，收集裂解液，10000转4℃离心10min，上请储存于-20℃备用。取20μL细胞裂解上请，根据DualLuciferaseReportAssaySystem试剂盒说明进行报告基因萤火虫荧光素酶及内对照海肾荧光素酶检测，仪器采用BeckmanCoulterDTX880。实验数据采用SPSS软件进行分析，采用T检验。

3结果

3.1报告基因重组质粒(pGL3NOX4)的构建和鉴定

以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。产物于1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果在约533bp处可以见到与预期大小相符的目的片段(图1)。PCR产物插入pGL3basic载体，得到重组质粒pGL3NOX4经XhoⅠ，BamHⅠ双酶切鉴定，显示有一条为约533bp片段(图2)，通过上海英俊生物公司测序证实，重组质粒目的片段与Genbank报道序列一致。

3.2细胞因子刺激A549细胞报告基因活性检测

用细胞因子TNFα，IFNγ刺激转染了报告基因pGL3NOX4的A549细胞，分别于刺激6、12、24小时裂解细胞测定荧光素酶活性。结果显示单独采用TNFα或IFNγ都能够刺激报告基因的表达，而联合使用两种细胞因子的刺激作用更强。在刺激6、12、24小时，两种细胞因子刺激实验组荧光素酶活性分别为未加细胞因子的阴性对照组(DMEM对照)荧光素酶活性的2.6、2.2、2.0倍。实验数值经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，P

4讨论

表达于中性粒细胞和单核/巨噬细胞的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶最先被发现，该酶是吞噬细胞呼吸爆发的关键分子，吞噬细胞通过呼吸爆发产生大量活性氧(ROS)，成为依赖氧杀菌机制的重要介质[1]。吞噬细胞NADPH氧化酶的催化亚基gp91phox位于细胞质膜，当细胞受刺激后，gp91phox与胞浆中其他亚基(p22phox，p47phox，p40phox，p67phox，和Rac)共同形成有活性的NADPH氧化酶复合体。

吞噬细胞gp91phox现在称为NOX2。与gp91phox结构同源的分子共同组成NOX蛋白家族，他们包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5，Duox1和Duox2。他们与NOX2一样均参与细胞ROS生成，所不同的是，NOX2似特异表达于吞噬细胞，而NOX蛋白家族其他成员在组织细胞有广泛表达，由于他们发现较晚，其生理功能研究有待深入[2-3]。活性氧往往作为第二信使参与细胞信号转导，在MAPKs信号通路、JAKSTAT信号通路、NFκB信号通路等，都有活性氧参与其中，这些信号传导与细胞分裂分化，转化，迁移，凋亡等过程密切相关，由此也提示NOX蛋白家族与上述重要生命现象关联[4-6]。

最初研究表明，NOX4在肾脏组织中大量的表达，它可能作为一种敏感性氧感受器，NOX4主要分布在鼠肾的近端小管和人肾单位远端，而促红细胞生成素(EPO)的生成与管周细胞相邻。在肝脏也表达少量NOX4的mRNA，提示N0X4可能作为EPO合成的氧感受器[7-8]。最近有研究发现，NOX4在中枢神经系统的神经元中也有一定表达。除了NOX2，NOX家族其他分子在机体天然免疫及炎症中的作用仍有待研究[9-10]。本实验构建了NOX4荧光素酶报告基因重组质粒，成功转染A549细胞，以此为模型，观察炎症细胞因子对NOX4表达的影响，结果发现TNFα、IFNγ刺激NOX4基因表达，这不但提示NOX4参与细胞炎症反应，同时为我们进一步探讨NOX家族在机体对抗微生物感染过程中的作用奠定了很好的基础。

参考文献

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基因重组篇2

【摘要】目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten，体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞，荧光显微镜检测Adpten的转染效率.Western印迹检测pten在HO8910PM细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞，Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达，当感染复数MOI为100时，体外转染效率高达90%以上.pten显著抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中，对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用，并能抑制其迁移.

【关键词】卵巢肿瘤；基因治疗；pten基因；腺病毒；细胞凋亡；迁移抑制

0引言

抑癌基因pten，即第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的基因，是继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因，其编码具有双重特异磷酸酶活性的蛋白，可以反向调控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKt信号传导途径，从而抑制细胞生长增殖.其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等［1-3］.在某些pten基因突变或缺失的癌细胞中过表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成，使其细胞周期停滞在G1期并发生细胞凋亡［4-5］，而且在某些没有pten基因突变的癌细胞中，使pten基因过表达也能抑制这些癌细胞生长，诱导其发生凋亡［6］；另外，pten基因还能抑制癌细胞的侵润转移，降低其迁移能力.这就提示pten基因用于癌症基因治疗有着重要意义.而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最多最广泛的就是腺病毒(adenovirus，Ad)载体，其具有在哺乳动物及其他多种生物细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性和不整合宿主细胞的性质，是一种比较安全，转染效率又高的载体［7］.本研究采用携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)，将pten基因导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，观察其在卵巢癌细胞中的表达，研究其对卵巢癌细胞生长抑制、迁移抑制、诱导凋亡的作用，对卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据.

1材料和方法

1.1材料人高转移卵巢癌HO8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞生物学研究所；野生型pten表达质粒（wtpten）为美国加州大学FrankFurnari教授惠赠；AdEasy腺病毒表达载体系统由美国休斯霍华德医学院及JohnHopkins肿瘤中心BertVogelstein教授惠赠，其中穿梭载体pAdTrackCMV带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)，在表达外源基因同时也能单独表达gfp，用于重组腺病毒的快速筛选以及转染率的测定；抗PTEN抗体为美国SantaCruz公司产品;HRP标记羊抗鼠IgG抗体和马抗山羊IgG均购自北京生物技术有限公司；MTT为美国Amerson公司产品.Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.

1.2方法

1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpten及阴性对照Adgfp［8］.HO8910PM细胞培养于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，置50mL/LCO2，37℃孵箱培养.

1.2.2Adpten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24h后吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicityofinfection，MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染，培养6h后，换完全培养液继续培养.24h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率.确定HO8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.

1.2.3WesternBlot检测转染细胞表达的PTEN蛋白取对数生长期细胞，按2×106接种于25cm2培养瓶中.常规条件培养24h后，按MOI=100加入病毒，设Adpten组和Adgfp组，培养6h后，换完全培养液继续培养.48h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0.1mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4h.TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN，Actin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1h.大量TBS洗涤去除未结合的二抗.ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.

1.2.4MTT法测定HO8910PM细胞增殖抑制率取对数生长期细胞，以5×103/孔接种于96孔板培养，常规条件培养24h后，吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，按MOI=100加入病毒，设Adpten组，Adgfp组，PBS空白对照组和本底对照组(只加完全培养液，不种细胞)，培养6h后，换完全培养液继续培养.每个时间点设6个平行孔，在指定时间(24，48，72h)加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，孵育4h后，小心吸弃孔内上清液，加入DMSO150μL/孔，振荡10min，490nm作为测定波长，570nm作为参比波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值.细胞增殖抑制率=［1-实验组（A570nm-A490nm）/本底对照组（A570nm-A490nm）］×100%.

1.2.5HE染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104接种于35mm培养皿中，24h贴壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并设加PBS为空白对照；病毒感染方法同1.2.4，24h后弃培养基，生理盐水漂洗，950mL/L乙醇固定15min，苏木素染色3～10min，自来水冲洗5～8min，5～10mL/L盐酸酒精分化数分钟，自来水冲洗5～8min，然后加温热水5～10min显蓝，自来水充分冲洗，伊红复染2min，再次用自来水充分冲洗，普通光学显微镜下观察.

1.2.6细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，按2×104/孔接种于6孔培养板，用RPMI1640完全培养基孵育24h后，用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹（长约2cm），用PBS洗3次后加入无血清RPMI1640培养基，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，继续培养48h后镜下观察.

1.2.7Hoechst33258凋亡染色取对数生长期HO8910PM细胞2×104/孔接种于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，48h后用固定液固定10min，PBS洗2次，Hoechst33258染色5min，荧光显微镜下观察.

统计学处理:本实验采用SAS8.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析(ANOVA)，P

2结果

2.1Adpten对HO8910PM细胞体外转染效率的测定Adpten在体外感染人高转移卵巢癌HO8910PM细胞具有较高的转染效率.在MOI=100时可以达到90%以上（图1）.

A:荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;B:同一视野下光学显微镜观察.

图1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM细胞的效果×200

2.2Western检测转染后PTEN蛋白的表达Western印迹分析结果表明，Adgfp感染后的HO8910PM细胞未见特异性条带；而Adpten感染后的HO8910PM细胞，则见到特异性条带，而且Pten蛋白表达量也较高（图2）.

图2WesternBlot检测PTEN蛋白的表达

2.3Adpten对HO8910PM细胞增殖的影响以MOI=100病毒感染后24，48，72h，通过吸光度值计算，Adpten的抑制率分别为(89.76±1.49)%，(91.11±1.38)%，(92.38±1.78)%，而Adgfp感染组分别为(8.14±2.16)%，(7.82±2.32)%，(6.16±2.86)%，二者比较，差异有统计学意义（P

2.4Adpten对HO8910PM细胞形态的影响重组腺病毒Adpten感染及非病毒感染(对照)的3组HO8910PM细胞，经HE染色光镜下观察可见，正常对照及Adgfp处理组细胞成片生长，细胞间隙紧密，胞质舒展，核分裂现象明显.Adpten处理组细胞则细胞间隙变大，胞质红，核固缩，易见凋亡小体(图3).

A:PBS对照组;B:Adgfp处理组;C:Adpten处理组.

图3Adpten感染对HO8910PM细胞形态的影响HE×400

2.5Adpten对HO8910PM细胞迁移能力的影响重组腺病毒Adpten感染后的指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞与对照组(PBS空白组和Adgfp组)比较，Adpten能有效地抑制HO8910PM细胞的迁移（图4）.

2.6Adpten诱导HO8910PM细胞凋亡Hoechst33258荧光染色结果显示，重组腺病毒Adpten感染HO8910PM细胞48h后，Adpten感染组出现典型的凋亡形态学改变，可见胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩，还可见膜包裹的凋亡小体.而PBS对照组和Adgfp组的细胞均未发生形态学的改变（图5）.

3讨论

随着分子生物学及分子遗传学的发展，癌基因的激活和抑癌基因的突变失活，是目前较为公认的肿瘤发生发展的重要原因之一.本文研究的抑癌基因pten，其突变和缺失常见于多种恶性肿瘤，与肿瘤的发生发展有着密切关系.目前普遍使用的肿瘤的基因治疗方法是导入外源性野生型抑癌基因补充或替代突变的抑癌基因.我们选用重组腺病毒载体导入抑A0，A1:PBS对照组;B0，B1:Adgfp处理组;C0，C1:Adpten处理组;A0，B0，C0:0h;A1，B1，C1:感染后48h.

癌基因pten，其极少发生插入突变，载体操作方便、宿主广泛、容易繁殖，并具有携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点，已广泛用于多种疾病的体内基因治疗.国外报道的AdEasy系统［9］除具有腺病毒载体的一般优点外，还具备以下优点：①在细菌体内完成同源重组，重组效率高，周期短；②利用含不同抗生素筛选重组子，简化了筛选工作；③经重组的腺病毒带有gfp基因，可直接通过荧光显微镜监测病毒的生成，病毒滴度的测定和对宿主细胞的转导效率的检测都较传统方法简便易行.我们利用AdEasy腺病毒载体系统构建了携带野生型pten基因的重组腺病毒，导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，证实pten基因在HO8910PM细胞中能高效地表达.通过MTT比色检测，发现Adpten对HO8910PM细胞具有显著的增殖抑制作用，能有效地抑制该癌细胞生长.细胞划痕实验证明Adpten能有效地抑制该癌细胞的迁移.Hoechst33258凋亡染色结果也表明pten具有诱导该癌细胞凋亡的作用.

本研究结果表明，携带野生型pten基因的重组腺病毒是一种高效的基因转移系统，能将pten目的基因转移到受体细胞中，对人高转移卵巢癌HO8910PM细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导效应，并能抑制该癌细胞迁移，为进一步的基因治疗卵巢癌的研究奠定了基础.

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基因重组篇3

目的利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1（DMT1）编码基因的重组腺病毒。方法应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1IRE的cDNA，亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中，形成转移质粒pAdTrackCMVDMT1IRE，在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组，利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆，经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1DMT1IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞，获得高滴度的重组腺病毒。结果RTPCR反应扩增出1841bp的片段，重组质粒阳性克隆pAdEasy1DMT1IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20kb的大片段和4.5kb的特征性片段，PCR鉴定扩增出DMT1的片段，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因DMT1IRE。转染293细胞后细胞表达GFP荧光，显示293细胞稳定表达外源性的DMT1IRE基因。结论携带DMT1IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功，获得高滴度的重组腺病毒，为DMT1基因进一步功能的研究提供基础。

【关键词】阳离子转运蛋白质类重组遗传腺病毒科

［ABSTRACT］ObjectiveToconstructarecombinantadenoviruscontaininggeneofDMT1withoutIRE.MethodsTheDMT1withoutIREgenewasobtainedbyRTPCR，whichwasthenclonedintotheshuttleplasmidpAdTrackCMVcontaininggreenfluorescentprotein(GFP)reportergene，followedbylinearizationoftheresultantplasmidpAdTrackCMVDMT1IREbyPmeⅠdigestionandsubsequentcotransformationintoE.coliBJ5183cellsalongwithanadenoviralbackboneplasmidpAdEasy1.TherecombinantplasmidpAdeasy1DMT1IREwasselectedforkanamycinresistance.TherecombinationpAdeasy1DMT1IREwascleavedwithPacⅠtoexposeinvertedterminalrepeats.PacⅠdigestedpAdEasy1DMT1IREwastransfectedinto293cells，inwhich，recombinantadenoviruswasgeneratedwithin7to10days.ResultsRTPCRshowedDMT1IREwas1841bp，pAdEasy1DMT1IREyieldedalargefragment，plusasmallerfragmentof4.5kbdigestedbyPacⅠ.PCR，showingthatpAdEasy1DMT1IREcontainedgeneDMT1withoutIRE.GFPexpressionwasvisualizedbyfluorescencemicroscopy.ConclusionTherecombinantadenovirusissuccessfullyconstructedandcanefficientlyexpressDMT1withoutIRE.ItoffersafoundationforfurtherstudyofthefunctionofDMT1.

［KEYWORDS］DMT1;Homologousrecombination;Recombinantadenovirus

近年来的研究显示，帕金森病（PD）病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化[1，2]。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破，为解释这一问题提供了重要的理论依据。二价金属离子转运蛋白1（DMT1）曾被称为具有天然抗性的巨噬细胞蛋白2（Nramp2），是新近发现的铁转运蛋白[3]。研究发现DMT1在脑内广泛表达[4]，提示DMT1在脑铁转运中起到非常重要的作用，可能参与了黑质内的铁聚积。本研究构建了携带DMT1IRE的重组腺病毒，为研究DMT1在铁聚积中的作用提供实验依据，有利于进一步阐明PD的神经元损伤机制。

1材料与方法

1.1材料

实验能用携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy1，大肠杆菌BJ5183、JM109和DH10B由本室保存。兔抗鼠DMT1IRE单克隆抗体购自AlphaDiagnostic公司。βactin抗体为Sigma公司产品，HRP标记的goatantirabbitIgG购自中山公司。人胚肾293细胞由本室保存。人胚肾293细胞用含体积分数为0.10的胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养液，于37℃、体积分数0.05CO2温箱中培养。

1.2方法

1.2.1RTPCR扩增目的基因应用Trizol提取RNA，应用巢式PCR的方法扩增DMT1IRE基因，外侧引物：5′AGGGTACCTCTAAGAACTCAGCCACTCAG3′，3′GGATACCCGAACACAGAACTTCGAACCA5′；内侧引物：5′AAGGTACCACCATGGTGCTGGGTCCTG3′，3′GTCTGCAAAACTTGTTTTCCGTTTTCGAACG5′。第一轮PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃1min，63℃1min，72℃2min，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。将第一轮PCR产物以1∶100稀释后用于第二轮PCR扩增。扩增产物于含溴化乙锭（0.5mg/L）的12g/L的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，紫外线透射仪下观察电泳结果。

1.2.2载体双酶切将DMT1IRE插入pMD18T载体测序，测序结果显示DMT1IRE序列正确，将载体pMD18TDMT1IRE和pAdTrackCMV分别用限制性核酸内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切，37℃水浴5h。用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，待DNA完全消化后（电泳显示单一条带），回收纯化酶切产物。

1.2.3目的基因与载体连接将目的基因定向亚克隆到pAdTrackCMV质粒上（质粒pAdTrackCMV含有CMV启动子、GFP报告基因、卡那霉素Kan抗性标志、PacⅠ酶切位点、PmeⅠ酶切位点）。将酶切后的目的基因和载体按1∶1、2∶1、3∶1的摩尔比混合，用T4DNALigase进行连接反应，将上述各种试剂加至0.5mL离心管中混匀，16℃过夜反应。

1.2.4穿梭质粒与腺病毒骨架载体的共转化取上述线性化和磷酸化处理的质粒pAdTrackCMVDMT1IRE与1μL(0.1μg)pAdEasy1质粒同时加入到用TSS法制备的感受态E.coliBJ5183中，将转化的BJ5183感受态菌液全部涂布于2～3个含有35mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养16～20h。挑取10～20个较小菌落，在含有35mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37℃振摇培养10～15h，碱裂解法小量提取质粒DNA。用8g/L琼脂糖凝胶电泳进行电泳迁移率分析，挑选质粒大小大于pAdEasy1的质粒，并用限制性内切酶PacⅠ酶切进行鉴定。

1.2.5重组腺病毒的包装重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48h后在荧光显微镜下观察细胞内的绿色荧光的表达。之后表达绿色荧光蛋白的细胞数目逐渐增多，转染后6d达高峰，细胞开始变圆、脱落，此时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，24h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒。

2结果

2.1重组腺病毒质粒的构建

RTPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，DMT1IRE为1841bp（图1A）。将目的基因片段重组到高效克隆载体pMD18Tsimplevector进行测序，双酶切结果显示连接成功（图1B）。将重组质粒pAdTrackCMVDMT1IRE行限制性核酸内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切分析，得到目的基因和长约9200bp穿梭载体片段（图1C），说明目的基因已连接到穿梭载体上。将重组腺病毒载体pAdDMT1IRE经PacⅠ酶切后行电泳检测，可观察到一条大于20kb的大片段和一条较小的DNA片段（4.5kb）（图1D），提示重组质粒构建成功。

图1重组腺病毒质粒构建琼脂糖凝胶电泳图基础研究（略）

A：PCR扩增目的基因DMT1IRE;B：pMD18TsimplevectorDMT1IRE重组质粒双酶切;C：pAdTrackCMVDMT1IRE重组腺病毒穿梭质粒双酶切;D：PacⅠ酶切鉴定

2.2重组腺病毒的包装

重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光，表明质粒转染成功，外源基因开始表达。之后表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞数目逐渐增多，转染后6d达高峰，细胞开始变圆、脱落，此时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，培养24h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒，所获病毒命名为AdDMT1IRE。

转贴于3讨论

PD病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化。由于铁离子的细胞毒作用和它能够促进羟自由基的产生，成为PD不容忽视的一个关键因素。目前已有足够的证据证实铁离子在神经退行性疾病中的现实意义[5，6]。

DMT1是GRUENHEID等[7]在1995年研究具天然抗性的巨噬细胞蛋白1（Nramp1）的过程中发现的一种新蛋白质，与Nramp1有高度同源性（达78％）和相似的二级结构。DMT1参与Fe2+转运，对系统性的铁摄取及细胞水平的铁摄取都起了至关重要的作用。已有报道PD病人脑黑质DMT1表达异常增高，这与PD病人脑内铁的异常沉积恰巧在同一个部位。因此，推断因DMT1的表达失控引起的脑铁代谢紊乱可能与PD的发生、发展有关，DMT1表达异常可能是导致PD病人黑质内铁增多的原因。对于DMT1在脑内的功能及其表达调控尚需进一步的研究证实，也许通过对其功能的进一步认识，将为阐明PD的神经元损伤机制提供有价值的理论依据。

重组腺病毒为基因表达研究与基因治疗提供了一种通用的方法。本实验首次采用了腺病毒载体系统来构建DMT1IRE的瞬时高表达载体，进而为研究DMT1的功能提供条件。构建重组腺病毒的方法有多种，用传统的方法构建重组腺病毒载体时，重组的过程是在真核细胞内完成的。该法需要同时向真核细胞内共转染两种质粒，分别是含大部分腺病毒基因组的骨架质粒和含有外源性目的基因的穿梭质粒。该法同源重组效率低，获得重组病毒有一定难度，而且不能完全避免野生型病毒的产生；需要多次空斑筛选，因而制备出腺病毒的时间较长，妨碍其广泛应用。1998年，国外首次报道了AdEasy系统，AdEasy系统可在原核细胞E.coliBJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程[8，9]。

本研究采用AdEasy系统，在较短的时间内成功地构建了重组腺病毒AdDMT1IRE，由于其携带GFP的编码基因，因此可在包装增殖的同时直接用荧光显微镜观察转染和感染效率，是高效便捷的重组腺病毒系统。重组腺病毒感染HEK293细胞后，在共聚焦显微镜下可观察到GFP表达随时间增加而增加。证明重组腺病毒可以成功感染HEK293细胞，并伴有GFP蛋白的正确表达。

综上所述，本实验成功地获得了高滴度的携带DMT1IRE基因的重组腺病毒，为DMT1基因的功能研究提供了基础，为研究脑铁转运、高铁对神经细胞的损伤及药物作用靶点提供实验依据。

【参考文献】

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[5]JIANGH，LUANZ，WANGJ，etal.Neuroprotectiveeffectsofironchelatordesferalondopaminergicneuronsinthesubstantianigraofratswithironoverload[J].NeurochemistryInternational，2006，49:605609.

[6]WANGJ，JIANGH，XIEJX.Ferroportin1andhephaestinareinvolvedinthenigralironaccumulationof6OHDAlesionedrats[J].EuropeanJournalofNeuroscience，2007，25:27662772.

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[8]HETC.Asimplifiedsystemforgenerationrecombinantadenoviruses[J].ProcNatlAcadSciUSA，1998，95:25092514.

基因重组篇4

CloningandsequencingofrecombinantplasmidaffectingsurvivingenetranslationbyRNAinterferencetechnique

【Abstract】AIM:ToclonetherecombinantplasmidaffectingsurvivingenetranslationbyRNAinterferenceandtoanalyzethenucleicacidsequenceoftherecombinantplasmidfornewgenetherapyfortumors.METHODS:TwoDNAsequencescontainingsmallhairpinstructureweredesignedandsynthesized.ThecomplementformwasobtainedbyannealingandbeingclonedintovectorpSilencer3.1H1hygroandtherecombinantplasmidwastransformedintostrainDH5α.Theplasmididentifiedbyrestrictionenzymewasusedforsequencing.RESULTS:Therecombinantplasmidwasclonedandtheaimedsequencewasobtained.CONCLUSION:Successfulcloningoftherecombinantplasmidhelpstofindanewgenetherapyfortumors.

【Keywords】survivingene;RNAinterfering;recombinantplasmid

【摘要】目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体，并进行测序鉴定.方法：设计具有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer3.1H1hygro中构建重组表达载体，转化DH5α菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定.结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论：Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功，可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录，供抗肿瘤研究参考.

【关键词】survivin基因；RNA干扰；重组表达载体

0引言

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近几年发展起来的新技术.用小片段RNA二聚体(smallinterferingRNA,siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导，成功排除了长片段双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象，但其主要障碍是长于30nt的双链RNA将激活抗病毒机制，导致非特异性的RNA转录降解.而体外合成21nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达［1-3］.本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(smallhairpinRNA,shRNA)构建重组表达载体，为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.

1材料和方法

1.1材料

含有人H1启动子的pSilencer3.1H1hygro质粒为美国Ambion公司产品，由西南医院皮肤科王继文博士赠送.克隆用大肠杆菌DH5α由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送.限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4DNA连接酶、核酸分子质量标准λHindⅢdigest,DL2000均为TaKaRa公司产品.E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒、E.Z.N.AR胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.

1.2方法

1.2.1Survivin基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用；扩增和纯化质粒pSilencer3.1H1hygro.根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(NoNM001168)，参考shRNA设计原则进行设计［4］，最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段.以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpinsiRNA)的干扰片段序列，并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.

1.2.2pSilencer3.1H1hygrosiRNA表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2μL与46μL退火缓冲液混合，利用PCR仪加热至95℃3min，然后70℃水浴,自然冷却至室温.用45μL的无酶去离子水稀释5μL的退火双链，使其终浓度为8mg/L.载体pSilencer3.1H1hygro经BamHⅠ和HindⅢ双酶切.将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和质粒pSilencer3.1H1hygro的阳性对照反应，置16℃过夜.将连接产物各取4μL分别接种于100μL的DH5α感受态细胞中进行转化.挑取单菌落扩增培养，E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提.用限制性内切酶BglⅡ分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定.得到的重组质粒分别命名为pSilencer3.1H1hygrosiRNA1,pSilencer3.1H1hygrosiRNA2,pSilencer3.1H1hygrosiRNA3.

1.2.3重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序.所用引物为M13+.

2结果

2.1载体双酶切鉴定回收酶切产物行12g/L琼脂糖凝胶电泳后，可见环状质粒已被切开,大片段约为4.491kb，小片段为61bp因太小而无法检测（图1）.

2.2筛选重组质粒pSilencer3.1H1hygrosiRNA1，pSilencer3.1H1hygrosiRNA2，pSilencer3.1H1hygrosiRNA3培养板上均有细菌克隆长出，形态和大小基本一致；pSilencer3.1H1hygro质粒的阳性转化对照有大量细菌克隆长出；阴性对照培养板上无细菌克隆长出，连接转化可能成功.

2.3单酶切鉴定重组质粒第2孔经BglⅡ单酶切的pSilencer3.1H1hygro，因该质粒无此酶切位点故仍保持环状结构；第4，6，8孔为经BglⅡ单酶切的三个重组质粒，因该重组质粒含有此酶切位点故可被酶切成线状结构（图2）.

2.4重组质粒测序鉴定测序结果均包含目的序列(图3）.

3讨论

肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病.肿瘤中细胞凋亡现象很可能是机体对抗肿瘤的主动措施，因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展及治疗中起着关键性的作用.细胞凋亡(apoptosis)受多个基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族.其中，survivin基因是IAP基因家族的新成员.1997年Ambrosini等［5］利用效应细胞蛋白酶受体1（effectorcellproteasereceptor1，EPR）cDNA在人类基因组文库中筛选克隆得到的新基因.SurvivinN端含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)分子，其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通过这些氨基酸残基与Caspase3和Caspase7结合抑制Caspase的活性，在COOH端有一个由40个氨基酸组成的α螺旋结构，通过α螺旋结构与细胞分裂微管结合，从而抑制细胞凋亡.Survivin基因特异性表达于人和鼠的胚胎发育组织，在终末分化的成人组织中不表达，而在转化细胞株和人体内大多数恶性肿瘤组织中明显表达［6］.它与细胞凋亡和增殖、肿瘤血管的生成密切相关，还参与细胞周期凋控，并影响着肿瘤的发生发展.因此，以survivin为靶点的肿瘤基因治疗成为肿瘤治疗研究的重要方面.

3.1H1hygrosiRNA3测序鉴定

抑制基因表达的方法很多，目前研究使用较多的主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、基因敲除等.反义RNA技术的使用量较大，抑癌效率低.而RNAi则具有选择余地大和扩增放大效应［7］，只需微量特异的dsRNA即可产生明显的抑癌效果，具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点.除了技术方面的差别，两者的作用机制也不同.RNAi技术中siRNA序列选择余地大，21~23nts中如果改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用，因此RNAi可以应用于单个核苷酸突变基因的抑制表达.以质粒为载体将siRNA导入细胞内，所形成的siRNA专一作用于靶向基因的细胞系可用于较长时间的功能研究［8-9］.RNAi技术与基因敲除技术相比，后者往往需要较长时间才能了解所缺失功能基因后的生物学现象，而前者则在转染细胞48h后即可了解抑制靶向基因表达后的生物学现象.

质粒pSilencer3.1H1hygro包括一种人H1RNA聚合酶Ⅲ启动子，利用相对单一的启动子和终止序列产生大量的小RNA.同时，位于启动子下游的shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后，单链的RNA配对形成短的dsRNA，引发RNA干扰.而且，该载体中含有可供筛选的潮霉素耐药基因和氨卞青霉素耐药基因，利于阳性重组子的克隆筛选.因此，我们根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列，参考shRNA设计原则设计出了三条阻断survivin基因表达的RNAi序列，并成功克隆至载体pSilencer3.1H1hygro，为进一步研究体内外抗肿瘤治疗提供新方法.

【参考文献】

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基因重组篇5

摘要：目的建立一种简便、快速基因分型方法，对广西人类免疫缺陷病毒（HIV-1）重组毒株gag基因区进行亚型鉴定。方法从HIV阳性样本中提取核酸，使用HIV-1M组通用引物对gag区进行第1轮扩增，第2轮使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同判断亚型。另外设计了一套引物，专门用于检测B'/C重组毒株。扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果54份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本4份（741%),CRF01-AE样本46份（8518%),4份（741）无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测出4份（100%)B'/C重组毒株，45份（9783%)CRF01-AE重组毒株，灵敏度为98%，特异性为100%。2种方法检测结果经差异性检验显示，P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。与基因分析结果吻合。重复实验显示，B'/C的平均重复性为100%(20/20),CRF01-AE为983%(59/60)。结论该方法具有简便、快速，高度灵敏度和特异性的特点，可直接对广西HIV-1重组毒株CRFO1-AEgag基因区进行分型。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反应

Rapididentificationforgagregionofcirculatingrecombinantformofhumanimmunodeficiencyvirustype1

Abstract：ObjectiveTodevelopeasimpleandrapidsubtype-screeningassayforthegagregionofthecirculatingrecombinantform(CRF)ofhumanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1）inGuangxi.MethodsProviralDNAfromHIV-positivesampleswereextractedandsubjectedtothefirstroundPCRwithuniversalprimersforthegagregionthatcandetectHIV-1Mgroupisolates.InthesecondroundPCR,twopairsofsubtype-specificprimersthatweredesignedtodetectsubtypeCandCRF01-AErespectivelywereaddedintoonetube.ThePCRproductsofdifferentsubtypescouldbedistinguishedinagarose-gelelectrophoresis.Anotherpairofsubtype-specificprimersexclusivelydetectingthetheprevalentrecombinantstrainsCRF07-BCandCRF08-BCwasdesignedandused.Additionally,allofthesesamplesweresequencedandanalyzedphylogenetically.ResultsDNAsequencingandphylogeneticanalysisofthegagregionofthe54samplesshowedthat4samples(7.41%)wereinfectedwithCRF08-BC,46(85.18%)withCRF01-AEand4(7.41%)remainedunclassifiable.Detectionofthesubtype-specificprimersetsrevealedthat4wereB'/C(100%),and45wereCRF01-AE(97.83%),withanadequatesensitivity(98%)andahighspecificity(100%).Non-specificbandsoccasionallyappearedbutdidnotinterferewithinterpretationoftheresults.Thephylogeneticanalysiswasconsistentwithsubtype-specificprimersetsandtheconsistentratewas98.15%.Theaveragereproducibilitywas100%forB'/Csamplesand98.3%forCRF01-AEsamples.ConclusionAsimple,rapidandlowcostassayisdevelopedforsubtype-screeningofCRFO1-AEinGuangxi.FortheB'/CstrainsinGuangxi,itneedstobeverifiedfurtherbyincreasingsamples.

Keywords：humanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1）；geneticsubtype；polymerasechainreaction(PCR)

人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度变异，不同亚型毒株其生物学特性及；分子流行病学特征均有所不同〔1〕，若能快速、准确地对HIV进行基因分型不仅有助于了解HIV-1转播规律，而且可为阐明HIV基因型与生物表型关系、药物耐药性等研究提供资料。近年来，我国学者〔2〕建立了一种多重巢式PCR法对我国HIV-1主要流行株进行鉴定亚型。然而，由于HIV-1的基因变异度极高，在传播过程中可产生许多具有相对独立的基因序列型别，使得不同地区各亚型间具有其自身的特异性。广西壮族自治区为国内HIV感染的高发区，大部分感染发生在经济尚不发达地区的人群中。因此，建立广西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，广西的优势流行株为CRF01-AE和CRF08-BC重组毒株〔3,4〕。为此，本研究针对这2种重组毒株gag基因区建立了一种亚型特异性引物PCR法的快速基因分型法。

1材料与方法

11样本来源从广西HIV-I主要流行区采集54份样本，经ELISA初筛和免疫蛋白印迹（WB）确认为HIV阳性样本。

12核酸提取采用QIAampBloodesMiniKit试剂盒（德国QiaGen公司）从每位感染者的抗凝全血中提取细胞DNA，并冻存于-80℃冰柜备用。

13HIV-1亚型特异性引物的设计亚型特异性引物的设计是整个方法建立的关键。设计的基本原则：设计的引物位点必须在各个亚型间高度特异，而在同一种亚型内部高度保守。在Primer50软件的帮助下设计出gag区的亚型特异性引物（表1)。

14HIV-1gag基因区的扩增用nested-PCR对HIV-1gag基因区进行扩增，第1轮使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反应条件：94℃5min,52℃1min,72℃2min30s,1个循环；94℃30s,52℃30s,72℃1min30s,30个循环；72℃10min。第2轮模板5μl，使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的2套亚型特异性引物（Cag-c1/Cag-c2,Cag-ae1/Cag-ae2),争套引物放入同一反应管中，为减少非特异性反应，使用热启动和降落PCR(TD-PCR）技术〔5〕，94℃5min，52℃1min,72℃2min30s,1个循环；94℃30s,52℃30s,72℃1min,3个循环；94℃30s,51℃30s,72℃1min,3个循环；94℃30s,50℃30s,72℃1min,3个循环；94℃30s,49℃30s,72℃1min,3个循环；94℃30s,48℃30s,72℃1min,25个循环，72℃10min。如果特异性引物PCR扩增出的目的条带判断为C亚型，则用专门用于检测B'/C重组毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亚型特异性引物Cgag-c1/Cgag-bc为内侧引物再进行PCR扩增，以判断是否为重组形式。反应条件：94℃2min,48℃1min,72℃2min,1个循环；94℃30s,48℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min。同时使用引物306/Cn-gag扩增所有样本并进行基因测序，用于系统树分析及亚型鉴定以验证特异性引物分型结果是否正确。反应条件：94℃2min,50℃50s,72℃1min,1个循环；94℃30s,50℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min。第1轮和第2轮PCR反应体系均为50μl,dNT/P浓度为200μmol/L,Taq酶为25U，引物浓度为04μmol/L,MgCl2浓度为15mmol/L。表1gag区PCR扩增使用的引物（略）内侧特异性引物注：R=A或G

15PCR产物检测取5μl第2轮PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭（EB）染色检测，紫外摄影拍照，根据Markers分子量大小来判定结果。C亚型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B'/C片段1079bp。

16序列测定对于全部经引物306/Cn-gag扩增的样本，经切胶，纯化后，以306为测序引物，提纯的PCR产物为模板，采用DNA测序试剂盒（美国ABI公司）,在PTC-220型多通道PCR仪（美国MJ公司）上进行测序反应。反应产物经提纯后，采用310型全自动毛细管DNA测序仪（美国ABI公司）进行序列测定和分析。

17序列分析（美国LosAlamos国家实验室HIV核酸序列库中提供）基因分型工具BLAST程序进行基因型鉴定；用ClustalX进行排序和MEGAversion21软件进行分析。亚型分析使用的各个亚型参考序列来自美国LosAlamosHIV基因数据库。

18检测该方法的重复性在CRF01-AE样本中随机选取12份，CRF08-BC4份，共16份样本使用上述方法重复5次。

2结果

21样本基因测序和系统树分析54份阳性样本中通过引物306/Cn-gag扩增最终获得50份样本的基因序列，经BLAST程序鉴定出4份样本gxmu0402,gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419为CRF08-BC重组毒株，余下46份为CRF01-AE重组毒株。将50份基因序列与国际各亚型标准株的基因序列进行系统树分析显示。4份CRF08-BC样本与CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份与CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份样本gxmu0432和gxmu0439与CRF01-AE93JPNH1和CRF01-AE93TH057十分接近。

22亚型特异性引物PCR扩增部分样本经亚型特异性引物PCR扩增后的电泳结果见图1和图2。根据不同亚型扩增出的目的带位点不同，判断出亚型结果。54份样本中，采用特异性引物共扩增出49份样本，其中C亚型4份，CRF01-AE重组毒株45份（9783%,45/46)。进一步使用B'/C重组特异性引物扩增C亚型特异性引物鉴定出来的4份样本，发现这4分样本均为B'/C重组毒株（100%,4/4)。以基因测序法为金标准，可知亚型特异性引物PCR法的灵敏度为98%，特异性为100%。

23亚型特异性引物PCR法的重复性重复实验采用4份CRF08-BC样本和12份CRF01-AE随机样本进行5次重复。结果显示，CRF08-BC重组毒株平均重复性为100%（20/20），而CRF01-AE在5次重复中有1次出现1份样本检测不出，其平均重复性为983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462图1部分CRF01-AE样本琼脂糖电泳结果（略）M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3:gxmu0418;4:gxmu0419图2B'/C样本琼脂糖电泳结果

24基因测序法与亚型特异性引物PCR法比较54份己确认的阳性样本，基因测序法检测并正确分型的样本是50份，检出率为9260%，特异性引物PCR法为49份，检出率为9074%。2种方法检测结果经差异性检验显示，χ2=0,P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。

3讨论

本研究结果表明，亚型特异性引物PCR方法对于亚型的鉴定结果与基因测序、系统树分析得到的结果是吻合的，该方法的特异性达100%。用亚型特异性引物扩增样本时，有时一会出现非特异性扩增条带，干扰实验结果。非特异性条带位置一般不在特异性位置。为防止误判，可以通过跑厚胶并且延长电泳时间，使目的条带与非特异性条带充分分开。通常在紫外灯下，非特异性条带要比目的条带弱。出现非特异性扩增条带通常有如下的原因：(1)引物与模板错配扩增产生，引物与模板亚型相符，不仅能在特异性位点上与模板结合，亦能在远离特异性位点的地方与模板结合，这种情况错配通常靠近引物5′端的位置，电泳时会出现两条带；(2)引物之间形成的引物二聚体，一般出现在80bp左右的位置，通过长时间电泳可使此条带消失；(3)某一亚型的特异性引物与另一亚型的模板错配扩增产生，因2套引物放入同一反应管中，所以可能出现此情况，为了避免此情况发生，因此，在设计引物时使引物在3′端与别亚型的模板至少有2个碱基产生错配。用本研究所建立起的方法对54份样本的gag基因区进行检测，发现有些样本在1200bp左右的位置会出现一条非特异性扩增，因第1轮PCR扩增的条带位置在1242bp,因此怀疑此非特异性扩增条带为第1轮PCR扩增出的目的带，将第1轮PCR产物与用亚型特异性引物扩增出的第2轮产物同时进行电泳，证实了这一推测。为了减少此情况的发生，可减少第1轮反应的模板量，同时在加入反应体系、模板和酶后尽量减少室温放置时间或在冰盒上操作。本实验结果表明，亚型特异性引物PCR法，灵敏度为98%，特异性为100%，结果显示，其灵敏度和特异性均较好。重复性实验显示，B'/C亚型的平均重复性为100%,CRF01-AE重组毒株为983%,说明一该方法在实际中是可行的。但由于CRF08-BC样本例数不多，因此，本研究所建立起的方法对于HIV-1B'/C重组毒株分型的准确性有待扩大样本量进一步证实。

参考文献

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基因重组篇6

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心／生命科学学院植物遗传育种研究所，贵阳550001）

摘要：以贵州师范大学荞麦产业技术研究中心建立的两个甜荞（Fagopyrumesculentum）重组自交系群体（Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1）的亲本为研究对象，选取了5个多态性好、带型清楚的随机引物进行RAPD分析，计算了每对亲本之间的相似度系数，并构建了各亲本的RAPD指纹图谱。结果表明，在Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1的亲本中，平均相似度系数分别为39．13％和42．69％；在构建的RAPD指纹图谱中，有29条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；有26条谱带为Lorena－3（P1）所独有，25条谱带为甜自21－1（P2）所特有。荞麦特异谱带可以作为品种鉴定的分子标记。

关键词：甜荞（Fagopyrumesculentum）；RAPD；多样性；DNA指纹图谱

中图分类号：S517文献标识码：A文章编号：0439－8114（2015）02－0284-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

甜荞（Fagopyrumesculentum）为荞麦大粒组类群7个生物学物种之一［1］。Chen［2，3］的试验研究表明，普通荞麦中存在着大量的形态变异，而对这些变异进行深入研究将在很大程度上有利于遗传育种。基因控制着生物体的性状表达和变异，研究DNA分子的多态性也会促进对形态变异的进一步探索，并在遗传育种中为选择强优势组合的亲本进行杂交和荞麦资源的鉴定提供科学依据［4］。

RAPD技术是以PCR为基础的一项检测物种DNA多态性的分子技术［5］。该技术的优点是DNA样品需求量小；无种属和基因组结构特异性，一套引物可用于不同生物基因组分析；试验成本低；试验技术简单，检测速度较快。RAPD在荞麦中应用主要集中在荞麦的遗传多样性和种间系统关系研究方面［6］。通过建立RAPD指纹图谱，寻找每个种类的恒定谱带和独特谱带，可以迅速准确地对荞麦种类进行鉴别。近年来，RAPD技术已应用于多种植物杂交组合后代鉴定［7，8］和种子纯度的检测等。Ohinshi等［9］、Tsuji等［10］利用AFLP和RAPD技术研究苦荞栽培品系和天然种群间的系统发育关系。Sharma［11］应用RAPD技术研究了荞麦属14个种之间的遗传多样性。Kump等［12，13］采用RAPD技术进行了苦荞33个栽培种之间遗传关系的分析。许瑾等［4］利用RAPD技术对荞麦属的9个品种进行基因组指纹图谱分析。谭萍等［14］采用RAPD方法对国内10个荞麦栽培种进行基因型分析，并建立了指纹图谱。Pan等［15］以F．esculentumMoench，F．esculentumvar．homotropicum及其杂交所建立的225株F2代分离群体为材料，进行了RAPD与STS标记分析和重要形态性状遗传分析，并由此构建遗传标记连锁图谱，共涉及87个RAPD标记，12个STS标记。覆盖基因组长度655．2cM。总的说来，由于普通荞麦自交不亲和，相关研究主要以荞麦品种或品系为材料，主要运用RAPD等标记。

在重组自交系中，利用亲本DNA样品进行RAPD标记引物筛选，并将重复性好的引物进行其可育F2代分离群体样本的PCR扩增，用以分析甜荞RAPD标记多态性和构建起分子遗传连锁图谱。本研究对普通荞麦重组自交系群体亲本组合（Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1）的亲本用5种随机引物的RAPD谱带进行多态性分析和指纹图谱建立，以期为其F2代自交系群体的进一步研究打下基础。

1材料与方法

1．1试验材料

本研究选用了甜荞重组自交系的4个亲本甜荞种，分别为Lorena－3、甜自21－1、甜自100和Homo。重组自交系的亲本组合为：Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1。甜荞品种由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。

1．2DNA提取

取2～3周苗龄的新鲜健康叶片约300mg置于研钵中，倒入液氮，研成粉末。将该粉末直接转入装有预热的含有15μLβ－巯基乙醇的1000μL2％CTAB提取缓冲液（质量浓度2％CTAB，100mmol／LpH8．0Tris－HCl，50mmol／LEDTA－Na2，1．4mol／LNaCl，质量浓度2％PVP）的5mL离心管中，轻轻摇动使其充分混匀，置于65℃水浴中保温60min（每隔20min轻轻颠倒混匀1次），加入酚／氯仿／异戊醇混合液（25∶24∶1，V／V／V），充分混匀，常温下静置10min，10000r／min离心10min。将上清液加入氯仿／异戊醇混合液（24∶1，V／V），轻轻混匀，室温下10000r／min离心10min。将上清液转移到干净的离心管中，加入2倍体积－20℃冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒离心管直至出现白色絮状沉淀，将离心管放在－20℃中沉淀10min。离心沉淀DNA并将沉淀用－20℃冰冻的体积分数为70％的乙醇洗涤两次，在室温下使DNA沉淀干燥。加入600μLTE缓冲液，完全溶解后，置于－20℃冰箱保存备用。

1．3引物

共使用了5个随机引物，各引物序列见表1。该引物从贵州师范大学荞麦产业技术研究中心设计的25个引物中选取，以亲本间多态性好、电泳带型清晰、重复性好为主要筛选原则。

1．4PCR反应体系

试验中，RAPD检测使用的PCR反应体系见表2。PCR反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性1min，Tm（引物不同温度不同）退火1min，72℃延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。

1．5统计分析方法

扩增产物于0．8％的琼脂糖凝胶中电泳，在BioSenSC805型全自动凝胶成像系统的Analysis工具栏中，点击消除背景图标以消除图像本底的干扰；点击自动检测所有泳道的条带图标以进行各泳道内条带检测；点击相对分子质量计算图标，以Marker泳道内的Marker条带的相对分子质量为标准设定相对分子量曲线图，关闭Marker窗口，则会显示各个条带的相对分子质量，统计各泳道内的条带数。

参考文献［16］，采用条带相似度系数分析条带的多样性。相似度系数SD＝（2nAB）／（nA＋nB），nA为A泳道内的DNA条带数，nB为B泳道内的DNA条带数，nAB是A、B泳道内共有的条带数。

2结果与分析

2．1亲本甜荞的RAPD电泳图谱

不同引物扩增的亲本甜荞的RAPD电泳图谱如图1和图2所示。

2．2亲本甜荞RAPD标记的多样性分析

根据筛选出的5个随机引物的RAPD扩增结果，可以对每对杂交组合中的两个亲本进行扩增条带的多样性分析，两对杂交组合亲本中各引物的扩增情况与相似度系数见表3和表4。

由表3可知，对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出92条谱带，平均每个随机引物产生了18．4条谱带。这些引物的扩增产物为17～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；其次为引物R52和R428，均为19条谱带；最少的为引物R41和R353，扩增出17条谱带。

对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）组合的所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表3）表明，在5个随机引物获得的92条谱带中，有18条谱带在两亲本间表现为相同谱带，RAPD标记的相似度系数为39．13％（36／92）。对于每一条引物的相似度系数来说，其变化范围为31．58％（6／19）～50．00％（10／20）。其中RAPD标记的相似度系数最高的引物是R1182，达到了50．00％，引物R428的标记相似度系数最低，为31．58％（6／19）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因组DNA水平上存在较低的RAPD标记相似度系数，即DNA水平上条带的多样性较为丰富。有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

由表4可知，对亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出89条谱带，平均每个随机引物产生了17．8条谱带。这些引物的扩增产物为15～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；而后依次为R52、R353、R41、R428，扩增出的谱带数分别为19、18、17、15。

对Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本组合所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表4）表明，在5个随机引物获得的89条谱带中，有51条谱带在两亲本间的表现存在差异性，RAPD标记的相似度系数为42．69％（38／89）。对每条引物的标记相似度系数来说，其变化范围为40．0％（6／15）～47．06％（8／17）。其中RAPD标记的相似度系数最低的引物为R428和R1182，相似度系数为40．00％，R41的标记相似度系数最高，达47．06％（8／17）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）基因组DNA水平上同样存在较低的RAPD标记相似度，也存在较高的多样性，将有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

2．3亲本甜荞的RAPD指纹图谱

根据全部随机引物扩增产物的数据统计分析结果，将能在亲本组合中稳定扩增出现的、且具有差异的特异性谱带用来构建亲本组内P1和P2的RAPD标记指纹图谱。在Homo（P1）×甜自100（P2）的亲本中，共扩增出56条差异性谱带（表5）；在Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本中，共扩增出51条差异性谱带（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）组合亲本RAPD指纹图谱存在较明显的差异性。前者中有28条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；后者中有24条谱带为Lorena－3（P1）所独有，24条谱带为甜自21－1（P2）所特有。因此，在每对杂交组合中，存在差异的谱带可看作是两亲本的特征性谱带，而由RAPD指纹图谱所反应的这些特征谱带可以作为鉴别亲本的依据，也可为进一步对杂交组合中亲本的DNA多态性及其他分子遗传研究打下基础。

3讨论

Deng等［17］利用7个随机引物对19个荞麦（包括甜荞和苦荞）品种进行RAPD分析，结果表明其平均多态性达94．89％，而本研究结果表明，甜荞重组自交系的两对亲本组合的平均相似度系数分别为39．13％（Homo×甜自100）和42．69％（Lorena－3×甜自21－1），再次在DNA水平上说明荞麦种间的多态性远高于种内多态性。同时，对同属甜荞品种的两个亲本组合而言，其低于50％的相似度系数也从DNA的角度解释了甜荞异花授粉、自交不亲和等生殖学特征所带来的物种基因重组的多态性现象。在对荞麦进行种类划分的研究中，部分种类难以从形态学上进行识别，分类特征也常存在较大变异，难以把握。本研究在DNA水平上进行的RAPD遗传标记分析可对荞麦品种鉴别和遗传歧化研究提供依据。

此外，本研究以重组自交系亲本为研究对象进行RAPD分析，发现自交系群体亲本之间存在较多的特异RAPD谱带，也可为以重组自交系为研究对象进行的相关农艺学特征遗传及分子标记研究奠定基础。

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